酿酒酵母中高通量DNA修复监测揭示单链与双链断裂诱导的染色质重构新机制

本研究针对DNA损伤修复过程中染色质动态重构机制这一关键科学问题，通过开发高通量三维成像流式细胞术(3D-IFC)和实时定量PCR技术，首次在活体酿酒酵母中捕捉到单链断裂(SSB)和双链断裂(DSB)共同诱导的HMLα-MAT位点快速接近现象。研究发现交配型转换过程中，两种DNA损伤类型均可触发10分钟内染色体构象变化，为理解真核生物基因组稳定性维持提供了新视角。

　　

在生命活动中，DNA时刻面临着内源性或外源性损伤的威胁，其中单链断裂(SSB)和双链断裂(DSB)是最具基因毒性的两类损伤。尽管科学家已发现同源重组(HR)等修复机制，但关于DNA损伤如何触发染色质三维结构动态变化这一基本问题仍存在认知空白。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的交配型转换(Mating-type switching)作为经典模型，其MAT位点被HO-核酸酶特异性切割后，需要以同源模板HML_α或HMR_a进行修复。然而，现有技术难以在活细胞中高精度捕捉这一动态过程，特别是对SSB与DSB诱导的染色质重构差异缺乏系统认知。

为解决这一难题，以色列理工学院Yoav Shechtman团队在《Scientific Reports》发表创新性研究。研究人员首先构建了携带"stuck"突变(MAT_a-stk)的酵母菌株，该突变导致HO诱导后产生SSB和DSB的混合群体。通过开发整合荧光报告系统(HO-CFP)和高灵敏度qPCR方法，实现了从DNA损伤发生(30分钟检出)到交配型转换完成(60分钟检出)的全过程监测。关键技术突破在于将柱面透镜引入成像流式细胞仪(3D-IFC)，使双色荧光阻遏蛋白-操纵子系统(FROS)标记位点的三维定位精度达60-80纳米，每分钟可分析数千个活细胞。

研究结果揭示多个重要发现：

1. 1.

   实时监测技术创新：建立的CFP荧光报告系统比传统Southern blot提前45分钟检测到转换事件，qPCR显示30分钟内即有30%细胞出现DNA损伤。

2. 2.

   FROS系统干扰效应：首次量化发现256xLacO和112xTetO重复序列的插入使转换效率降低2-3倍，主要源于游离荧光阻遏蛋白的干扰而非操作子序列本身。

3. 3.

   染色质快速重构现象：3D-IFC数据显示，HO诱导后10分钟即出现HML_α-MAT距离缩短120纳米(从470至350纳米)，且该现象在仅3.5%细胞发生DSB修复的情况下仍显著存在，提示SSB同样能触发染色质重构。

4. 4.

   损伤类型差异响应：虽然SSB和DSB均可诱导位点接近，但仅DSB会导致更紧密的物理接触(＜200纳米)，这可能是启动HR修复的关键阈值。

讨论部分指出，该研究颠覆了"仅DSB能驱动同源模板搜寻"的传统认知，提出重组增强子(RE)可能通过Fkh1蛋白的FHA结构域响应不同损伤类型。技术层面，3D-IFC的高通量特性成功克服了FROS系统导致的低转换率(3.5%)对统计分析的影响，为活细胞染色体动态研究树立了新标准。这些发现不仅深化了对DNA损伤应答机制的理解，更为癌症等基因组不稳定相关疾病的治疗策略开发提供了新思路。