KH和R3H结构域协同作用：致病菌全局RNA结合蛋白KhpB的RNA识别机制解析

本研究揭示了致病菌中关键RNA结合蛋白KhpB（又称EloR）通过KH和R3H结构域协同识别RNA的分子机制。研究人员通过X射线晶体学解析了Thermus thermophilus KhpB在RNA结合前后的结构，发现两个结构域形成复合RNA结合位点，需至少7个核苷酸才能稳定结合。该研究首次阐明了R3H结构域的RNA结合模式，为理解细菌转录后调控及开发新型抗菌靶点提供了结构基础。

　　

在细菌的生存竞技场中，RNA结合蛋白如同精准的分子指挥家，调控着基因表达的每一个节拍。近年来，科学家们在多种致病菌中发现了一个神秘的"双面特工"——KhpB蛋白（又称EloR），它同时装备着两种RNA结合武器：保守的KH（K-homology）结构域和神秘的R3H结构域。这个独特的组合使KhpB成为调控细菌形态、毒力和应激反应的核心玩家，特别是在缺乏Hfq和ProQ等经典RNA伴侣蛋白的病原体（如具核梭杆菌Fusobacterium nucleatum）中，KhpB更是独揽全局RNA调控大权。然而，这个分子特工如何同时运用两种"武器"捕捉RNA目标，一直是未解之谜。

为揭开这一谜团，Kenji Fukui团队在《Nature Communications》发表了突破性研究成果。研究人员选择极端嗜热菌Thermus thermophilus的KhpB（ttKhpB）作为模型，通过X射线晶体学（分辨率2.65-2.99 ?）首次捕获了RNA结合前后KhpB的精细结构。结合凝胶迁移实验（EMSA）和圆二色谱分析，系统阐明了KH与R3H结构域协同工作的分子机制。

主要技术方法

研究采用重组表达纯化ttKhpB蛋白，通过分子置换法解析晶体结构（SPring-8同步辐射光源BL38B1线站）。使用10-mer单链RNA（5'-CCCCCCCCCC-3'）进行共结晶，通过凝胶迁移实验验证结合特性（检测5-10 nt RNA），结合位点突变体（R153A/H157A和G83D）通过PrimeSTAR定点诱变构建。采用差示距离矩阵分析量化构象变化，AlphaFold3预测异源二聚体结构。

Crystal structure of the RNA-free form of the ttKhpB dimer

研究发现RNA-free状态的ttKhpB以二聚体形式存在，通过KH结构域的α1和α3螺旋形成疏水界面（接触面积657 ?²）。与AlphaFold2预测一致，N端37个残基呈现非结构化特征。结构比对显示其与Clostridium symbiosum KhpB（PDB 3GKU）具有4.1 ?的Cα RMSD值，证实二聚化模式在进化中保守。

Coordinated RNA-binding by the KH and R3H domains of ttKhpB

突破性发现来自RNA复合物结构：7个核苷酸（C1-C7）像分子桥梁般横跨两个结构域——5'端（C1）被R3H域捕获，3'端（C2-C7）由两个KH域共同固定。这种"双手协同"机制解释了为何至少需要7 nt RNA才能稳定结合（凝胶迁移实验验证）。静电表面显示正电荷斑块精准匹配RNA结合位点，溶剂可及表面积分析显示C1-C4核苷酸埋藏面积最大（658.5 ?²总埋藏面积）。

Specific interactions with RNA in the KH and R3H domains

R3H域的Arg153-His157 motif通过静电作用（Arg153）和碱基堆积（His157）识别C1，突变实验（R153A/H157A）证实其关键作用。出乎意料的是，KH域的经典GXXG motif（Gly83-Gly86）并不直接参与RNA结合（G83D突变无影响），而是由His94、Arg97等碱性残基主导磷酸骨架识别。研究还发现KhpB对RNA/DNA无显著选择性，且碱基特异性识别有限（仅Thr106与C6氨基接触），这与其体内广谱RNA结合特性一致。

RNA-dependent conformational changes of ttKhpB

RNA结合引发显著的构象重排：R3H域的α4螺旋位移使结合裂隙闭合，二聚界面接触面积增至702 ?²（新形成Thr88-His94氢键）。差异距离矩阵分析显示KH-R3H域相对位移最显著。有趣的是，虽然晶体中仅一个结合位点可见完整RNA，但两个亚基呈现对称构象，暗示变构调控。Hill系数1.7证实结合存在正协同效应。

Model structure of the KhpA/KhpB heterodimer

通过AlphaFold3预测的KhpA/KhpB异源二聚体模型显示，其采用与同源二聚体相似的KH域二聚化界面。但异源二聚体仅含一个R3H域，可能影响RNA结合协同性与特异性，这为理解KhpA-KhpB功能分工提供了结构线索。

这项研究首次揭示了R3H结构域的RNA结合模式，破解了KhpB"双结构域协同"的工作密码。其发现具有三重重要意义：首先，阐明了KhpB通过磷酸骨架主导、碱基辅助的广谱RNA识别策略，这与Hfq、ProQ等"RNA伴侣"的工作模式异曲同工，暗示KhpB可能也具有RNA分子伴侣功能；其次，为针对KhpB开发新型抗菌药物（如破坏其RNA结合界面的小分子）提供了精确的分子蓝图；最后，研究揭示的构象变化机制为理解其他含R3H域蛋白（如人类Smu bp-2）的功能提供了范式。在具核梭杆菌等缺乏Hfq的病原体中，这项发现尤其重要，因为干扰KhpB功能可能成为阻断其致癌关联的新策略。