结构解析指导工程化设计：高特异性弗林蛋白酶抑制剂的开发与应用

本研究针对前蛋白转化酶（PCs）活性失衡与多种疾病相关的难题，通过X射线晶体学和生物化学方法揭示了PCs的激活机制。研究人员基于结构优化了PC1/3前结构域的多碱基次级切割位点环，结合弗林蛋白酶特异性纳米抗体构建了融合蛋白抑制剂，其抑制活性达1.2 pM且对弗林蛋白酶的选择性比PC5/6高25,000倍。该成果为癌症、病毒感染等疾病的靶向治疗提供了新策略，相关技术已成功应用于抑制H7N7流感病毒复制。

　　

在生命活动中，前蛋白转化酶（Proprotein convertases, PCs）家族如同精密的分子剪刀，负责剪切包括生长因子、激素前体在内的多种蛋白。其中弗林蛋白酶（furin）作为该家族的典型代表，其异常活性与癌症转移、病毒感染等重大疾病密切相关。然而，由于PCs家族成员活性位点高度保守，开发高特异性抑制剂面临巨大挑战——就像要在几乎相同的锁具中制造只开特定锁的钥匙。更棘手的是，现有的PCs抑制剂普遍存在稳定性差、易被降解等问题，严重限制了其临床应用价值。

这项发表在《Nature Communications》的研究通过多学科交叉方法破解了这一难题。研究团队首先采用X射线晶体学解析了PC1/3前结构域与弗林蛋白酶的复合物结构，发现次级切割位点环（secondary cleavage site loop）的关键调控作用。通过核磁共振（NMR）技术，他们捕捉到组氨酸72（His72）作为pH感应开关的分子机制。基于这些结构信息，研究人员对PC1/3前结构域进行工程化改造：一方面通过突变多碱基序列（77-81位点）阻断自剪切，另一方面用非质子化的氨基酸替代His72以增强酸性环境稳定性。最终将优化后的前结构域与特异性纳米抗体（nanobody Nb14）融合，构建出新一代抑制剂。

关键技术包括：1）使用HEK293S细胞表达系统制备重组PCs蛋白；2）采用微晶衍射技术（收集80套数据）解析难以结晶的蛋白复合物结构；3）结合纳米差示扫描荧光法（nanoDSF）评估蛋白热稳定性；4）基于AlphaFold3预测融合蛋白三维结构；5）通过噬斑形成实验检测H7N7/SC35M流感病毒的抑制效果。

【工程化PC1/3前结构域实现稳定高效的弗林蛋白酶抑制】

研究人员系统比较了五种次级切割位点突变体（M1-M5）的抑制活性，发现将77位精氨酸突变为丙氨酸（M2）可使抑制常数K_i降至0.32 nM。通过晶体结构分析揭示，该突变体通过形成稳定的β-转角构象增强结合力。特别值得注意的是，在pH 6.0的酸性条件下，野生型前结构域抑制活性显著降低，而M2突变体仍保持稳定抑制能力。

【His72介导pH感应机制的结构基础】

核磁共振数据显示，His72的咪唑环通过氢键网络固定次级切割位点环的空间构象。当pH降至6.0时，His72质子化（pK_a=4.82）导致该氢键网络破坏，解释了前结构域在酸性环境不稳定的分子机制。将His72突变为亮氨酸（M9）后，复合物熔点（T_m）在pH 6.0和7.4时分别达到71.8°C和72.5°C，显著优于野生型的63.1°C和65.6°C。

【纳米抗体融合策略实现超高特异性抑制】

将优化后的M9前结构域与靶向P结构域的纳米抗体Nb14融合，构建的F1融合蛋白对弗林蛋白酶的K_i达1.6 pM，且对PC5/6的选择性提高36,000倍。晶体结构显示，前结构域占据活性位点，而纳米抗体结合在远端表面，两者协同作用实现"双锁"抑制机制。在细胞实验中，10 μM F1可使H7N7流感病毒的HA蛋白剪切完全抑制，病毒滴度降低10⁴倍。

这项研究通过结构引导的蛋白工程策略，成功解决了PCs抑制剂特异性与稳定性的关键难题。其创新性体现在：1）首次阐明PCs前结构域pH感应机制的结构基础；2）开发出首个融合纳米抗体的前结构域抑制剂；3）证实该策略在抗病毒治疗中的应用潜力。特别是F1融合蛋白25,000倍的选择性突破，为开发靶向PCs家族特定成员的精准药物提供了全新范式。该成果不仅对癌症、纤维化等疾病的治疗具有重要价值，也为应对新发病毒疫情提供了技术储备——鉴于弗林蛋白酶在SARS-CoV-2等病毒激活中的关键作用，这类抑制剂或将成为应对未来疫情的通用武器。