揭示HUWE1泛素连接酶对小分子药物的选择性泛素化修饰机制及其在癌症治疗中的潜在应用

《Nature Communications》：Selective ubiquitination of drug-like small molecules by the ubiquitin ligase HUWE1

【字体：大中小】 时间：2025年09月04日 来源：Nature Communications 15.7

编辑推荐：

　　研究人员发现HUWE1泛素连接酶能够特异性修饰药物样小分子，揭示了一种新型的非蛋白底物泛素化机制。通过结构生物学、生物化学和细胞生物学等多学科技术，证实BI8622/BI8626等小分子抑制剂实际上是HUWE1的底物，其氨基基团可被泛素化修饰。该研究拓展了对泛素系统底物选择性的认知，为开发基于小分子泛素化的新型治疗策略提供了理论依据。

在真核细胞中，泛素-蛋白酶体系统（Ubiquitin-Proteasome System, UPS）通过选择性标记靶蛋白进行降解，调控着几乎所有的生理过程。传统认知中，泛素（Ubiquitin, Ub）修饰的底物都是蛋白质，但近年研究发现泛素系统还能修饰非蛋白生物分子，如膜磷脂、脂多糖等。这种突破性发现开辟了泛素生物学的新篇章。然而，外源性小分子药物是否也能成为泛素系统的底物，这一可能性尚未被探索。

德国马克斯·普朗克多学科科学研究所的Barbara Orth、Pavel Pohl等科学家在《Nature Communications》发表的研究，首次揭示了人类HUWE1泛素连接酶能够特异性修饰药物样小分子。HUWE1作为HECT家族（Homologous to E6AP C-terminus）的重要成员，在DNA修复、转录调控和蛋白质质量控制等过程中发挥关键作用，被认为是潜在的癌症治疗靶点。然而，针对HECT型E3连接酶的小分子抑制剂开发一直面临挑战，特别是其抑制机制往往不明确。

研究人员最初在研究HUWE1抑制剂BI8622和BI8626的作用机制时，意外发现这些化合物并非传统意义上的抑制剂，而是HUWE1的底物。通过多学科技术方法的整合，包括：

1.
体外泛素化反应体系重建（含E1、E2、E3和ATP）
2.
质谱技术（LC-MS/MS）鉴定小分子-泛素缀合物
3.
分子排阻色谱（SEC）分离分析反应产物
4.
分子动力学模拟预测小分子结合构象
5.
点击化学标记技术追踪细胞内的泛素化小分子
6.
定量蛋白质组学分析细胞全局变化
7.
CRISPR/Cas9基因编辑构建HUWE1敲除细胞系

HUWE1HECT抑制剂通过关键氨基基团被泛素化

研究发现BI8622和BI8626含有的伯氨基是其被泛素化的关键位点。通过设计系列衍生物（表1），证实去除或修饰该氨基会完全消除泛素化活性。质谱分析明确检测到泛素C端与化合物共价连接的肽段（表2），证明这是典型的异肽键连接。

泛素化修饰需要完整的酶促级联反应

SEC分析显示小分子泛素化严格依赖E1（UBA1）、E2（UBE2L3）和HUWE1HECT的催化活性（图2j,k），且需要泛素C端的双甘氨酸 motif（图2i）。分子动力学模拟预测了BI8626的氨基亲核攻击泛素C端羧基的四种可能构象（Supplementary Fig.11），与AlphaFold3预测结果一致。

HUWE1对小分子底物具有选择性

比较不同HECT结构域（E6AP、NEDD4、HACE1等）发现，HUWE1对小分子的泛素化活性显著高于其他HECT酶（图3d,e），这与早期抑制实验显示的HUWE1选择性相符。有趣的是，所有测试的HECT结构域都显示出一定的小分子修饰能力，表明这可能是HECT家族的一个普遍特征。

全长HUWE1的底物竞争性抑制

全长HUWE1（HUWE1FL）也能有效泛素化这些小分子（图4a,b）。通过开发基于炔烃标记衍生物的点击化学检测策略（图4g），研究人员证实小分子与蛋白质底物（如MCL1）存在竞争关系（图4i）。这种竞争性抑制机制解释了这些化合物在早期高通量筛选中被误判为抑制剂的原因。

细胞内的非特异性泛素化修饰

通过质谱检测（图5a）和点击化学标记（图5b-e），研究证实BI8626衍生物在HEK293T细胞中确实被泛素化。然而，CRISPR敲除HUWE1仅使泛素化信号降低约25%（图5e,f），表明细胞内存在其他E3连接酶也能催化小分子泛素化。蛋白质组学分析显示BI8626处理引起广泛的蛋白质丰度和泛素化位点变化（Supplementary Fig.20），说明其缺乏细胞特异性。

这项研究从根本上改变了我们对泛素系统底物范围的理解，首次证明外源性小分子药物可以被泛素化修饰。虽然当前的小分子化合物（如BI8626）还缺乏足够的HUWE1特异性，但这一发现为开发新型治疗策略提供了多种可能：1）设计特异性E3连接酶的探针底物；2）开发基于小分子泛素化的靶向蛋白降解剂；3）探索将"前药"转化为新型功能分子的可能性。从更广泛的视角看，这项研究开辟了利用泛素系统创造新型化学修饰策略的新途径，为药物开发和疾病治疗提供了全新的思路。