肺炎链球菌启动子自然变异通过DNA链滑动机制调控感染表型异质性的进化策略

这篇研究揭示了肺炎链球菌（S. pneumoniae）糖苷水解酶操纵子启动子区域的多腺苷酸序列通过DNA复制过程中的链滑动（strand slippage）机制产生自然变异，形成78种启动子模式（PR）。这种变异通过调节nanB操纵子表达影响神经氨酸酶（NanA/NanB）活性和荚膜多糖（cps）厚度，在单次感染中产生群体异质性（PR1/PR2共存），增强鼻咽定植持久性（+A插入使-10/-35间隔增至17bp），同时揭示启动子变异是细菌在有限转录调控机制下的进化适应策略。

　　

肺炎链球菌启动子自然变异的感染调控机制

Highlights

• 特定肺炎链球菌启动子含有连续腺苷酸序列

• 同聚物序列驱动DNA链滑动和启动子突变积累

• 启动子突变导致单次感染中基因表达异质性

• 糖捕获位点的启动子突变涉及成本-效益权衡

研究发现肺炎链球菌（D39株）nanB操纵子启动子区域存在8-13个连续腺苷酸序列，这些同聚物区域在DNA复制过程中极易发生链滑动，导致-10与-35元件间间隔序列长度变异。实验证明单个腺苷酸插入（PR1→PR2）使间隔从16bp增至17bp，显著增强下游操纵子（含nanB、β-D-半乳糖苷酶和ABC转运系统基因）表达水平，RNA-seq显示表达量提升2-4倍。这种变异在21,155株临床分离株中鉴定出78种启动子模式，其中PR1（65%）和PR2（13%）最为普遍。

A single-nucleotide intergenic insertion drives increased expression of the operon containing nanB

通过小鼠鼻咽定植模型实验进化发现，两个独立进化群体（C20-3和C20-8）均在nanB启动子获得相同单核苷酸（A）插入。该插入位于σ⁷⁰样启动子-10（TATACT）和-35（TTTCAAG）元件之间，使间隔区从16bp（PR1）变为17bp（PR2），符合大肠杆菌σ⁷⁰启动子共识间隔。RT-qPCR证实PR2使nanB表达量提升3.5倍，神经氨酸酶活性增强2倍。引人注目的是，启动子-10元件序列突变（TATACT→TCTACG）虽不影响间隔长度，但仍导致表达量显著下降，显示序列特异性调控。

Increased operon gene expression influences infection outcomes

表型分析显示PR2菌株呈现：①细胞链长度增加（与定植正相关）；②鼻咽定植密度提高10倍（感染14天）；③肺感染负荷降低50%（24小时）。值得注意的是，PR2菌株表现出：①粘液捕获减少60%（猪粘蛋白模型）；②气液界面培养的人原代呼吸上皮粘附增加；③荚膜厚度减少15%（FITC-葡聚糖排除法）。这些变化与神经氨酸酶NanB活性增强相关，其通过切割α2,3连接唾液酸暴露上皮结合位点，但代价是增加对吞噬杀伤的敏感性（THP-1巨噬细胞杀伤率提高40%）。

Substantial sequence variation in the nanB operon promoter among clinical isolates

全球基因组分析揭示：①南非Drakenstein队列中38.6% PR1和82.3% PR2定植事件存在多启动子共存；②GPSC9谱系偏好PR4（与定植相关），GPSC1偏好PR3（与侵袭病相关）；③非荚膜株（如GPSC60 NCC2）92.3%单独携带PR2。实验证实PR2在免疫幼稚宿主优势显著，但在预存免疫力小鼠中丧失优势，而PR1/PR2混合感染则能突破免疫屏障，提示群体异质性的适应意义。

Strand slippage drives promoter diversity

分子机制研究表明：①nanB启动子在无钒酸盐时复制错误率达4.96%（对照基因仅0.001%）；②1mM钒酸盐（MutS抑制剂）使错误率升至8.7%；③全基因组筛查发现11-26个含≥8A的启动子/菌株，如cps操纵子启动子已知调控荚膜变异。这种"可调控的不稳定性"使肺炎链球菌能在有限调控因子（仅SigA/SigB两个σ因子）情况下，快速探索表型空间。

讨论

该研究阐明启动子同聚物序列是细菌表型可塑性的重要驱动力：①时空异质性：上呼吸道富含α2,3唾液酸（NanB底物），下呼吸道以α2,6为主（NanA底物）；②代谢权衡：唾液酸代谢抑制半乳糖代谢（Leloir途径），减少荚膜前体；③免疫逃逸：PR2单独存在时易被清除，但与PR1共存时可维持定植。这种通过DNA复制固有错误产生调控多样性的策略，为理解病原体适应机制提供了新视角。