无脊椎脊索动物Ciona robusta中枢神经系统的二维与三维神经肽组学图谱解析

本研究针对无脊椎脊索动物Ciona robusta中枢神经系统(CNS)神经肽空间分布不清的难题，采用质谱成像(MSI)技术构建了23种神经肽的单细胞水平二维/三维图谱。研究揭示了脑神经节三功能分区结构，发现基因相关肽的差异定位及多肽共定位现象，为理解脊索动物神经肽系统的进化起源提供了重要线索。该成果发表于《iScience》，创新性地将质谱成像与转基因可视化技术结合，突破了传统免疫组化的技术瓶颈。

　　

在生命科学领域，神经肽作为神经系统重要的信号分子，其空间分布特征对理解脑功能结构至关重要。然而传统免疫组化技术面临抗体交叉反应、多色标记数量有限等技术瓶颈，而转录组分析又无法反映前体蛋白翻译后加工产生的多种成熟肽的差异分布。这些限制使得无脊椎脊索动物——这一连接无脊椎动物与脊椎动物的关键进化节点生物的神经肽系统研究长期停滞。Ciona robusta（海鞘）作为现存与脊椎动物亲缘关系最近的生物之一，其中枢神经系统结构简单却功能完备，是研究脊索动物神经肽系统起源的理想模型。

为解决这一科学难题，由Tomohiro Osugi和Honoo Satake领衔的研究团队在《iScience》发表创新性研究。他们整合质谱成像(MALDI-TOF MSI)与PC2启动子驱动Kaede荧光标记的转基因技术，首次在单细胞水平绘制了Ciona脑神经节的二维和三维神经肽组学图谱。这项研究不仅揭示了神经肽的空间分布规律，更发现了前体蛋白加工产物在神经元中的差异化分布现象，为理解脊索动物神经肽系统的进化提供了全新视角。

关键技术方法包括：1) 利用PC2>Kaede转基因品系特异性标记肽能神经元；2) 优化20μm分辨率的MALDI-TOF MSI技术实现单细胞水平检测；3) 开发线性插值算法整合质谱数据与荧光图像；4) 采用Visium空间转录组进行对比验证；5) 构建交互式三维图谱展示系统。所有实验均使用日本国家生物资源项目提供的成年海鞘神经复合体样本。

【质谱成像分析Ciona神经肽】

通过优化的MSI工作流程，研究团队成功检测到23种神经肽在脑神经节中的特异性分布。其中CiTK-I主要分布于背侧区域，与免疫组化结果高度一致。值得注意的是，来自同一前体的CiLF-2、CiLF-5、CiLF-6和CiLF-7显示出截然不同的空间分布模式，这种基因相关肽的差异定位无法通过转录组分析获得，凸显了MSI技术的独特优势。

【神经肽组学图谱构建】

整合36个连续切片的分析数据，研究发现Ciona脑神经节可划分为三个功能区域：1) 背吻侧区富含cionin（胆囊收缩素同源物）和CiNTLP-5；2) 背尾侧区聚集CiTK-I、CiNTLP-6和GALP等生殖相关肽；3) 腹侧区以CiLF-5和CiNTLP-3为主。三维图谱进一步证实了这种分区结构，其中背吻侧区与排卵调控相关，背尾侧区则同时含有促进（CiTK-I）和抑制（CiNTLP-6）卵泡生长的拮抗肽。

【神经肽共定位特征】

通过Tanimoto系数分析发现：CiTK-I与CiLF-3/CiLF-6在背吻侧区共定位，而与CiNTLP-6在背尾侧区共现。这些多肽共定位的神经元可能通过协调分泌不同功能的神经肽来精细调控生殖过程。特别是CiTK-I/cionin共定位神经元，可能同时调控卵泡生长和排卵的连续生理过程。

【与空间转录组对比】

研究团队发现Visium空间转录组与MSI结果在神经元密集区域具有一致性，但在神经纤维密集区存在显著差异。例如citk mRNA在内区广泛分布，而CiTK-I肽信号仅在外层神经元区域被检测到，这种转录本与成熟肽的空间差异进一步证实了翻译后加工调控的重要性。

这项研究通过创新性的技术组合，首次在单细胞分辨率揭示了无脊椎脊索动物中枢神经系统的神经肽组学全景。其核心发现包括：1) 证实了脑神经节的三分区功能结构；2) 揭示了基因相关肽的神经元特异性加工机制；3) 发现了多肽共定位的普遍存在。这些发现不仅为理解Ciona的神经内分泌调控提供了框架，更重要的是，为追溯脊椎复杂神经肽系统的进化起源提供了关键证据。该研究所建立的技术路线也为其他模式生物的神经肽研究提供了可借鉴的范式，将推动进化神经生物学研究进入新的维度。