转录偶联核苷酸切除修复在人类细胞中修复黄曲霉毒素B1诱导的甲酰胺嘧啶加合物的机制研究

本研究揭示了黄曲霉毒素B1(AFB1)代谢产物AFB1-Fapy dG在人类细胞中的修复机制。研究人员通过构建位点特异性荧光报告系统，首次证实该加合物主要依赖转录偶联核苷酸切除修复(TC-NER)通路清除，而全局基因组NER(GG-NER)和碱基切除修复(BER)贡献有限。这一发现为理解AFB1致肝癌的分子机制提供了新视角，对肝癌预防策略开发具有重要指导意义。

　　

黄曲霉毒素B₁(AFB₁)是广泛污染农作物的强致癌物，其代谢产物AFB₁-Fapy dG可导致特征性G→T突变，与肝癌发生密切相关。尽管已知该加合物在细菌中通过核苷酸切除修复(NER)清除，但人类细胞的修复机制长期未明。这项发表在《NAR Cancer》的研究首次系统阐明了人类细胞修复AFB₁-Fapy dG的分子通路。

研究团队创新性地开发了荧光多参数宿主细胞复活(FM-HCR)报告系统，通过构建含位点特异性AFB₁-Fapy dG的质粒，结合基因编辑细胞模型和患者来源细胞系，系统评估了不同修复通路的贡献。关键技术包括：1) 化学合成AFB₁-Fapy dG修饰的寡核苷酸；2) 构建BFP_AFB₁-Fapy报告质粒；3) 利用CRISPR-Cas9建立XPA/XPF等基因敲除细胞系；4) 流式细胞术定量修复效率；5) 分析XP和Cockayne综合征患者来源细胞系的修复缺陷。

Construction and validation of BFP_AFB1-Fapy reporter assay

研究人员通过化学氧化法制备AFB₁-Fapy dG修饰的寡核苷酸，并将其精确插入报告质粒的转录链。质粒转染实验证实，该加合物能显著抑制转录，在NER缺陷型XP2OS细胞中表达率仅为5.3%，验证了报告系统的敏感性。

Immortalized fibroblasts from xeroderma pigmentosum patients are defective in AFB1-Fapy repair

XPA缺陷的XP2OS细胞对AFB₁-Fapy dG修复效率显著降低(6%)，而回补XPA可使修复效率提升至36%。类似地，XPF或XPG缺陷细胞也表现出严重修复障碍，证实核心NER因子在修复中的必要性。

Knockout of XPA or XPF ablates AFB₁-Fapy dG repair in U2OS cells

在TK6和U2OS细胞中，XPA或XPF敲除使修复效率下降4-6倍。通过稳定回补实验排除脱靶效应，进一步验证了NER核心机制的作用。

CSA, CSB, and UVSSA are required for efficient AFB1-Fapy repair, while XPC is not

最关键的发现是：TC-NER特异性因子CSB、UVSSA敲除使修复效率降低约4倍(48.1%→13%)，而GG-NER起始因子XPC敲除无影响。Cockayne综合征患者细胞(CS3BE和CS1AN)的修复缺陷及回补实验结果强化了这一结论。

Neil1 does not make a major contribution to BFP_AFB1-Fapy repair

尽管Neil1糖苷酶在体外可切割AFB₁-Fapy dG，但在U2OS和XP2OS细胞中，NEIL1敲除并未显著影响报告基因表达，提示BER通路贡献有限。

研究首次明确TC-NER是人体细胞修复AFB₁-Fapy dG的主导通路，这一发现解释了为何AFB₁暴露者肝癌中常见转录相关突变。该机制研究为开发针对AFB₁致癌过程的干预策略提供了新靶点，特别是提示增强TC-NER活性可能降低肝癌风险。建立的FM-HCR技术平台为研究其他DNA加合物的修复机制提供了范例。