基于海洋来源嗜热几丁质酶(BtChi)的降解机制开发新型抗真菌药物的研究

针对日益严重的耐药性念珠菌感染问题，研究人员从海洋芽孢杆菌中克隆表达了一种热稳定几丁质酶(BtChi)，通过优化表达条件获得高活性重组酶，证实其能有效抑制白色念珠菌(C. albicans)生长，MIC达5 μg/mL，为开发新型抗真菌药物提供了潜在候选。

　　

真菌感染已成为全球公共卫生的重大威胁，尤其是耐药性念珠菌感染每年导致160万人死亡。现有抗真菌药物如多烯类、唑类和棘白菌素类药物因交叉耐药性日益失效，开发新型抗真菌策略迫在眉睫。白色念珠菌(C. albicans)作为常见机会性致病菌，在免疫力低下人群中可引发从黏膜感染到侵袭性念珠菌病等多种疾病。特别值得注意的是，早产儿因其免疫系统发育不完善，60.8%的死亡率与白色念珠菌感染相关。面对这一严峻形势，靶向真菌细胞壁关键组分几丁质的降解酶——几丁质酶(Chitinase)因其独特的作用机制，成为抗真菌药物开发的新方向。

研究人员从海洋环境这一未被充分开发的极端酶资源库入手，从深海分离的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)中克隆表达了一种新型几丁质酶基因(BtChi)。该研究采用分子克隆、蛋白表达优化、酶学特性分析及抗真菌活性评价等技术路线，系统研究了该酶的生物学特性及其抗真菌潜力。样本来源于印度卡纳塔克邦马尼帕尔高等教育学院生物技术系保藏的海洋细菌菌株(保藏号MCC 5021)。

3.1 基因克隆与表达优化

通过Gibson组装法将去除信号肽的BtChi基因克隆至pET22b(+)载体，在E. coli BL21(DE3)中表达。采用JMP软件设计20组实验优化表达条件，发现0.1 mM IPTG、25°C诱导48小时可获得最佳可溶性表达。纯化获得分子量约71 kDa的重组蛋白，经SDS-PAGE和Western blot验证。

3.3 水解机制研究

TLC和HPLC分析显示，BtChi特异性水解胶体几丁质产生二聚体(壳二糖)，表明其为外切几丁质酶。酶活性随时间变化研究显示2小时达到峰值9.79 U/mL。

3.5 最适pH与稳定性

BtChi在pH 7.0的Tris-HCl缓冲液中活性最高(9.77 U/mL)，在pH 4-8范围内保持75%以上活性。荧光光谱分析证实其在pH 4.5-8结构稳定。

3.6 最适温度与热稳定性

该酶在40°C活性最高，30-70°C保持96%活性，70°C孵育24小时后仍保留显著活性，展现优异热稳定性。

3.7 金属离子影响

Na⁺在100 mM浓度下使酶活性提高24%，而EDTA显著抑制活性，表明金属离子对酶功能至关重要。

3.8 动力学参数

以胶体几丁质为底物测得K_m为0.03 mg/mL，V_max为1.37 U/mL，显示极高底物亲和力。该酶还可水解不同脱乙酰度(80-90%)的壳聚糖。

3.9 抗真菌活性

纸片扩散法显示10 μg BtChi对白色念珠菌形成10 mm抑菌圈。肉汤稀释法测得MIC为5 μg/mL，MTT法证实其抑制效果与两性霉素B相当。显微镜观察显示处理后的真菌细胞明显皱缩。

该研究成功从海洋细菌中开发出一种具有临床应用潜力的新型抗真菌几丁质酶。BtChi的广谱pH稳定性(4-8)、优异热稳定性(30-70°C保持活性)和高底物亲和力(K_m 0.03 mg/mL)使其成为理想的工业用酶候选。特别值得注意的是，其对白色念珠菌的强效抑制作用(MIC 5 μg/mL)为应对日益严峻的耐药真菌感染提供了新思路。与现有抗真菌药物相比，几丁质酶通过降解真菌细胞壁关键组分几丁质发挥作用，不易产生交叉耐药性。研究还发现Na⁺可显著增强酶活性，这为后续制剂开发提供了重要参考。该成果不仅为抗真菌药物开发提供了新候选，也为海洋微生物资源的开发利用树立了典范。未来研究可进一步探索BtChi与其他抗真菌药物的协同作用，并评估其在动物模型中的治疗效果和安全性。