枯草芽孢杆菌核糖体相关内切核酸酶Rae1通过切割停滞核糖体上游mRNA调控基因表达的新机制

本研究揭示了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)中核糖体相关内切核酸酶Rae1通过识别停滞核糖体上游12核苷酸位点切割mRNA的分子机制。研究人员发现Rae1对fliY mRNA的切割依赖延伸因子P(EF-P)缺失导致的SPP基序核糖体停滞，并通过toeprint实验证实spyA mRNA终止密码子处的核糖体停滞现象。研究阐明了终止密码子与切割位点距离(12 nt)的关键作用，以及SpyA/BmrX肽链序列对Rae1切割的特异性调控。该发现为理解细菌翻译质量控制提供了新视角，发表于《Nucleic Acids Research》。

　　

在细菌的基因表达调控中，mRNA的稳定性与翻译过程紧密偶联，形成精细的质量控制网络。然而，关于核糖体停滞如何触发特定mRNA降解的分子机制仍存在诸多未知。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为革兰氏阳性模式菌，其RNA降解机制与大肠杆菌等革兰氏阴性菌显著不同，尤其缺乏对核糖体相关核酸酶调控机制的认识。这项研究聚焦于核糖体相关内切核酸酶Rae1——一个在厚壁菌门、蓝细菌和高等植物叶绿体中保守存在但功能未知的酶类，旨在揭示其如何通过感知翻译停滞状态来调控mRNA命运。

研究人员采用Northern blot、引物延伸和toeprinting等关键技术，结合体内外翻译-切割实验系统。使用枯草芽孢杆菌W168及其突变株（包括△rae1、△efp等）作为研究对象，通过整合pHM2质粒构建系列报告基因。体外实验采用纯化的B.subtilis 70S核糖体、Rae1及释放因子RF1/RF2，配合³⁵S标记的体外翻译体系。

Rae1在fliY mRNA上的切割依赖SPP停滞基序

通过构建fliY△截短体，发现EF-P缺失时Rae1在距第二个脯氨酸密码子12 nt上游切割mRNA（图1）。突变SPP基序（P165A P166A）使切割效率降低2.2倍，证实核糖体停滞是切割前提。

终止密码子处的核糖体停滞驱动切割

Toeprint实验显示spyA mRNA的UAG终止密码子处存在核糖体停滞（图2橙色箭头），而+1移码突变体无此现象。关键发现是：当终止密码子与Rae1位点距离从12 nt增至30 nt（spyA+18nts），切割完全消失；而重新引入12 nt间距（spyA UAG+18nts）可恢复敏感性（图3）。

释放因子调控切割效率

RF1对UAG终止密码子的低效识别促进停滞：spyA(UAG)的Rae1敏感性（5.9倍）高于spyA(UGA)（2.1倍）。体外实验显示过量RF2可抑制UGA转录本的切割（0.2倍），而RF1对UAG转录本无影响（图6），表明终止效率与切割负相关。

肽链序列的关键作用

spyA-AAmod（14/17氨基酸突变）虽保持12 nt间距却丧失切割活性（图7）。N端删除实验显示：保留最后13个氨基酸（⁵ELLMHYTMEKDQV¹⁷）的gfp融合体仍具Rae1敏感性，而更短的片段则失效（图9）。E5A突变显著降低切割效率，提示该位点空间位阻对停滞的贡献。

该研究首次阐明Rae1通过"测量"终止密码子距离（12 nt）和解读特定肽链序列来识别停滞核糖体的双重机制。这一发现不仅解释了spyTA毒素-抗毒素系统和bmrBXCD多药外排泵的转录后调控原理，更揭示了细菌中新型翻译质量控制通路——不同于大肠杆菌SmrB或酵母Cue2，Rae1代表了一类通过切割停滞核糖体尾部（而非A位点）来耦合翻译与mRNA降解的独特机制。鉴于Rae1在多种病原菌中的保守性，该研究为开发新型抗菌策略提供了潜在靶点。