广东桑树灰斑病病原菌Pseudocercospora mori的鉴定及其分子检测技术研究

本研究首次系统鉴定了中国广东省多地桑树灰斑病的致病菌为Pseudocercospora mori，通过形态学观察、高通量测序（Illumina Hiseq2500/4000）、分子系统发育分析（ITS/Cyt b/COI基因）和柯赫氏法则验证，揭示了该病原菌的生物学特性与分子特征。研究开发了基于rDNA序列的特异性PCR引物（W1724f/W2196r），检测灵敏度达3×10?2 ng/μL，可早期诊断叶片、枝条及土壤中的病原体，为桑树病害防控提供了关键技术支撑。

　　

引言

桑树（Morus atropurpurea）作为中国原产的多年生草本植物，在蚕桑产业中具有重要经济价值。然而，高温高湿环境下易发的真菌性叶斑病严重影响桑叶产量和品质。本研究聚焦广东省六个地区的桑树灰斑病样本，通过多学科技术手段揭示了Pseudocercospora mori的致病机制与传播规律。

材料与方法

样本采集与症状观察

从广州、韶关、清远等地采集典型病叶，记录不同区域的病斑特征：广州样本呈灰色霉层状，翁源样本为黑色染料状斑点，而阳山样本因管理良好仅表现轻微黑色粉末状病征。

病原菌纯化与形态学分析

采用宿主连续接种法纯化病原孢子，显微镜下观察到两类分生孢子：长型（53.410 μm，6个隔膜）和短型（26.220 μm，3个隔膜）。Calcofluor White染色证实孢子细胞壁含几丁质，AOPI染色显示4°C储存60天后仍具活性。

分子鉴定技术

1. 1.

   高通量测序：Illumina平台测序获得4.64 Gb数据，注释显示Pseudocercospora占比25.10%，为优势菌群。

2. 2.

   rDNA组装：拼接出5469 bp全长序列（GC含量50.67%），包含18S（1726 bp）、ITS1（150 bp）、5.8S（158 bp）、ITS2（149 bp）和28S（3286 bp）区域，其中ITS区GC比例显著高于其他区域。

3. 3.

   条形码基因分析：基于ITS、Cyt b和COI构建的系统发育树均将病原菌归类于Pseudocercospora属，但与近缘属Cercospora遗传距离较远。

柯赫氏法则验证

接种健康桑叶30天后，100%出现典型病斑（直径0.5–1 cm）。切片显示栅栏组织坏死，而海绵组织未受侵染，证实病原菌通过气孔侵入但仅定殖于中下层组织。

结果与讨论

生态适应性

Pseudocercospora mori在土壤和枝条中可长期存活（10²–10³孢子/g土壤），其传播依赖风雨和农事操作。冬季修剪残留枝条成为重要初侵染源。

检测技术突破

设计的特异性引物W1724f/W2196r可检测低至3×10^?2 ng/μL的病原DNA，较传统培养法（需5–7天）大幅提升效率。该技术适用于早期潜伏感染和田间环境监测。

防控启示

研究建议：1）清除病叶与枝条残体；2）土壤消毒；3）避免桑园周边种植其他桑科植物。未来需探究土壤微生物群落对该病原的拮抗作用。

结论

本研究通过多维度证据链将桑树灰斑病病原明确为Pseudocercospora mori，开发的分子检测工具为病害预警提供了新策略。病原菌在亚热带环境中的生存策略及其与宿主的互作机制仍需进一步解析。