FLT3L联合GM-CSF诱导的树突状细胞通过重塑肿瘤微环境驱动广谱CD8+ T细胞抗肿瘤应答

本研究创新性地采用FLT3L联合GM-CSF（FL/GM-DCs）体外诱导树突状细胞（DCs），通过单细胞测序（scRNA-seq）和流式分析揭示其独特亚群组成——富含常规cDC1/cDC2亚群且具有增强的交叉抗原呈递能力。相比传统GM-CSF/IL-4诱导的DCs（GM/IL4-DCs），FL/GM-DCs能更有效激活肿瘤特异性CD8+ T细胞并重塑肿瘤微环境（TME），通过促进细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）浸润和减少免疫抑制成分实现显著抗肿瘤效果，为下一代DC免疫治疗平台提供理论依据。

　　

Phenotyping distinct subpopulations in FLT3L/GM-CSF based culture method with protein expression

研究团队通过流式细胞术和Western blotting系统比较了FL/GM-DCs与GM/IL4-DCs的表型差异。关键发现包括：FL/GM-DCs中CD11c⁺MHCII^high群体占比达32.7%，且高表达cDC1标志物XCR1和转录因子IRF8；而GM/IL4-DCs则以CD172a⁺cDC2为主且完全缺失cDC1特征。值得注意的是，FSC^lowSSC^high群体中15.3%细胞共表达XCR1/CLEC4a4，提示存在DC前体亚群。低剂量GM-CSF（10 ng/mL）可协同FLT3L将DC分化比例从19.9%提升至38.4%，而高浓度（100 ng/mL）则导致单核/巨噬细胞分化。

Single-cell sequencing reveals heterogeneous DC clusters in FL/GM-DC

单细胞转录组分析10,303个FL/GM-DCs细胞，鉴定出21个亚群。FL/GM-DCs中cDC占比38.59%（含6.7% cDC1和34.4% cDC2），显著高于GM/IL4-DCs的4.2%。cDC2呈现高度异质性：Cluster 2高表达ISG⁺特征基因（ISG15/IFI205）和抗原交叉呈递相关基因Apol7c；Cluster 7同时表达pDC（TCF4）和cDC（ZBTB46）标记；Cluster 10则富集促炎因子（IL12B/TNF）。伪时序分析显示FL/GM-DCs分化过程中cDC1相关基因（IRF8/BATF3）持续上调，而单核标志物（CD14/CEBPB）逐渐下调。

Ex vivo-differentiated FL/GM-DCs effectively activate anti-tumor immunity in vitro

功能实验证实：虽然GM/IL4-DCs的OVA-FITC吞噬能力更强，但FL/GM-DCs在100μg/mL OVA刺激下H-2K^b-SIINFEKL呈递水平显著更高（p<0.01）。迁移相关标志物CCR7和CD103在FL/GM-DCs中表达率分别达72.3%和29.5%。与OT-I T细胞共培养时，FL/GM-DCs诱导的CD8⁺ T细胞增殖率（25.2% vs 14.9%）和CD44⁺活化比例均显著优于GM/IL4-DCs。细胞因子检测显示FL/GM-DCs分泌更高水平的IL-12p70（p<0.001）和更低水平的IL-6。

Enhanced tumor infiltration and lymph node homing of FL/GM-DCs with prolonged survival in vivo

在MC38荷瘤模型中，CD45.1⁺ FL/GM-DCs在肿瘤组织的浸润量是GM/IL4-DCs的2.1倍（day14），且64.4%细胞保持MHCII⁺CD86⁺活化状态。淋巴结归巢实验显示，FL/GM-DCs组CD45.1⁺CD8⁺ T细胞比例随时间递增（day7→day14），而GM/IL4-DCs组无此趋势。抗体阻断实验证实CD8⁺ T细胞缺失会完全消除FL/GM-DCs的抗肿瘤效果，而CD4⁺ T细胞阻断反而增强疗效，提示Tregs的免疫抑制作用被解除。

FL/GM-DC therapy remodel immune microenvironment and induce CD8⁺ specific anti-tumor activity

单细胞免疫组库分析发现：FL/GM-DCs治疗组中T/NK细胞比例提升47%，Tex/pTex克隆扩增幅度达67.5%（对照组52.9%）。Top5 TCR克隆中4个特异性富集于Tex群体，且克隆共享数从37增至60。MPs群体中TAMs减少62%而cDCs增加3.8倍，但M1/M2比例保持平衡，这与F4/80阻断实验未影响疗效的结果一致。

Vaccination with FL/GM-DCs protects against tumor challenges

预防性接种实验中，FL/GM-DCs使B16F10肿瘤体积缩小68%（p<0.001），免疫组化显示肿瘤内CD8⁺ T细胞密度增加3.2倍。但在治疗性实验中，MC38模型响应优于B16F10，可能与两者TAMs含量差异（MC38：高；B16F10：低）导致的效应机制不同有关。

Discussion

该研究首次在单细胞层面解析了FL/GM-DCs的异质性，证实其通过ISG⁺ DCs亚群和Apol7c介导的交叉呈递途径激活多克隆CD8⁺ T细胞应答。遗留问题包括：需通过XCR1-DTR模型验证cDC1的具体贡献，以及比较人源HSPCs与单核细胞来源DCs的疗效差异。这些发现为优化DC免疫治疗方案提供了新思路。