工程化枯草芽孢杆菌构建及其在特定分子量聚-γ-谷氨酸生产中的应用研究

本研究通过基因编辑技术构建了可动态调控聚-γ-谷氨酸（γ-PGA）分子量（Mw）的工程化枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株。通过敲除水解酶基因cwlO、pgdS和ggt，γ-PGA分子量提升220.1%（2.42×107 Da），产量提高47.81%（8.44 g/L）；结合IPTG诱导型启动子调控PgdS表达，实现9.55×104-2.15×107 Da宽范围Mw可调，为γ-PGA的多元化应用提供高效生产策略。

　　

引言

聚-γ-谷氨酸（γ-PGA）是由D/L-谷氨酸通过γ-酰胺键连接形成的天然聚合物，具有无毒、可降解等特性，广泛应用于食品、医药、农业等领域。其分子量（Mw）直接影响应用场景：低Mw（<400 kDa）适用于药物缓释载体，高Mw（>400 kDa）可用于重金属吸附，超高分子量（>4,000 kDa）则可作为肥料增效剂。传统生产依赖多菌株体系，限制了γ-PGA的开发潜力。

方法

研究以枯草芽孢杆菌168为底盘，通过整合组成型（P_aprE、P₄₃）和诱导型（P_xylA）启动子激活γ-PGA合成酶基因簇pgsBCAE表达。进一步采用基因敲除技术构建单基因（ΔcwlO、ΔpgdS、Δggt）、双基因及三基因缺失菌株，并引入IPTG诱导的P_grac启动子动态调控PgdS表达。发酵实验采用5-L生物反应器，优化碳源（甘露醇）、温度（37°C）、通气量（1.5 vvm）等参数。

结果

1. 1.

   启动子筛选：P_aprE驱动的菌株BS1产量最高（3.06 g/L），但P_xylA在甘露醇为碳源时产量提升26.67%（6.08 g/L），且解除葡萄糖抑制。

2. 2.

   水解酶缺失效应：三敲除菌株BS10（ΔcwlOΔpgdSΔggt）的γ-PGA Mw达2.42×10⁷ Da（+220.1%），产量8.44 g/L（+47.81%），显著优于单/双敲除菌株。

3. 3.

   动态调控：通过IPTG添加时间调控PgdS活性，实现Mw从9.55×10⁴ Da（IPTG 16 h添加）至2.15×10⁷ Da（无IPTG）的精准控制，产量维持6.28-8.57 g/L。

4. 4.

   放大生产：5-L发酵罐中，优化条件下γ-PGA Mw范围8.3×10⁴-1.87×10⁷ Da，最高产量7.76 g/L，验证工业化可行性。

讨论

研究揭示了PgdS对Mw调控的核心作用，其内切水解活性显著影响γ-PGA链长。相比其他芽孢杆菌（如B. amyloliquefaciens），枯草芽孢杆菌168更适于生产超高分子量γ-PGA。甘露醇碳源策略克服了葡萄糖对P_xylA的抑制，而IPTG诱导系统简化了传统多启动子调控的复杂性。

结论

该工程菌实现了γ-PGA分子量的广谱可调（10⁴-10⁷ Da级），突破了单一菌株生产限制，为γ-PGA在医疗、环保、农业等领域的定制化应用奠定基础。