活细胞定量表征技术揭示干细胞生物力学动态重塑机制

这篇研究创新性地运用原子力显微镜（AFM）的高分辨率力曲线成像技术，实现了化学刺激下骨髓间充质干细胞（hMSCs）拓扑结构与生物力学特性的同步动态监测。通过定量成像（QI）模式，首次在单细胞水平连续追踪细胞刚度（Young's modulus）与细胞骨架（微丝/微管网络）重构的时空关联，揭示了细胞骨架调节剂（如细胞松弛素D、诺考达唑等）对干细胞力学特性的差异化调控规律，为干细胞命运调控的力学生物学机制研究提供了全新工具。

　　

活细胞定量表征技术突破干细胞力学研究瓶颈

1 引言

人类间充质干细胞（hMSCs）因其多向分化潜能成为组织工程的核心细胞来源。近年研究发现，细胞骨架（cytoskeleton）不仅是维持细胞形态的支架，更是力学信号转导（mechanotransduction）的核心媒介——当细胞感知外界刚度刺激时，肌动蛋白（actin）与微管（microtubule）网络的重构会直接调控干细胞分化命运。例如，模拟脑组织（0.1-1 kPa）、肌肉（8-17 kPa）或骨胶原（25-40 kPa）的基质可分别诱导神经、肌肉或成骨分化。然而传统技术（如荧光成像、牵引力显微镜）难以实现活细胞力学特性的动态监测，这成为揭示力学生物学机制的关键瓶颈。

2 结果与讨论

2.1 AFM与共聚焦成像的关联验证

通过原子力显微镜（AFM）定量成像（QI）模式获取的拓扑图与荧光染色图像高度吻合（图1）。采用曲率半径10 nm的探针测得hMSCs刚度达118.5±10.5 kPa（核周区）与55.73±2.4 kPa（核区），较传统球形探针数据高1-2个数量级，证实尖锐探针对细胞骨架局部特征的敏感捕获。刚度分布图显示肌动蛋白纤维（actin fibers）对应区域刚度显著提升，纵向剖面分析揭示单个纤维刚度可达27 kPa（图1g）。

2.2 细胞骨架干扰剂的差异化效应

四种化学处理呈现特征性响应（表1）：

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  细胞松弛素D（CytD）：1 μg/mL浓度下30分钟内即导致肌动蛋白解聚，细胞刚度下降22%（图4c），纤维结构完全消散；

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  布莱比斯塔汀（blebbistatin）：抑制肌球蛋白II（myosin II）后，单个纤维刚度骤降50%（图5g），但纤维形态仍存续；

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  诺考达唑（nocodazole）：微管破坏引发延迟响应，60分钟后整体刚度降低30%（图6c），提示微管网络对actin的力学支撑作用；

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  秋水仙碱（colchicine）：反常促进actin聚合，使细胞刚度提升47%（图7c），纤维密度显著增加。

2.3 时空分辨率下的动态追踪

通过200分钟连续扫描，首次捕捉到单细胞尺度下的力学重塑过程（图3）。CytD处理后细胞能在90分钟内重建骨架，而blebbistatin的抑制效应不可逆。值得注意的是，nocodazole的微管破坏导致actin纤维刚度呈梯度下降（图6g），暗示局部粘附点或纤维捆绑可能维持残余张力。

3 实验方法

采用QI模式AFM（JPK Nanowizard IV）在37°C Leibovitz培养基中扫描，以Hertz模型拟合力-压痕曲线。为规避基底效应，压痕深度控制在细胞厚度的20%以内，并通过Garcia校正模型优化数据精度（图S2）。

4 结论与展望

该研究建立了活细胞力学动态监测的金标准，未来可结合拉伸装置或智能材料（如温敏水凝胶），进一步解析机械刺激与干细胞命运的因果关联。当前技术仍受限于样品粘附强度与模型选择，超高速AFM的发展将助力捕捉更快速的力学响应事件。这项突破为组织工程提供了从"静态调控"迈向"动态编程"的关键技术支撑。