生理pH动态调控的蛋白冠演化机制：二氧化硅纳米颗粒细胞摄取与炎症反应的关键调控因素

本文揭示了生理pH变化通过调控纳米颗粒表面蛋白冠（PC）组成和构象，进而影响其细胞摄取和免疫应答的分子机制。研究创新性地证明酸性环境（pH 5.0）可增加蛋白吸附量并诱导构象变化，显著促进巨噬细胞（RAW264.7/dTHP-1）和肿瘤细胞（A549）对二氧化硅纳米颗粒（SMNs）的摄取，同时通过降低补体蛋白C3和免疫球蛋白含量、增加调节蛋白C4BPA等机制减轻炎症反应（ROS/IL-1β/TNF-α/IL-6）。该发现为肿瘤靶向纳米药物的设计提供了关键理论依据。

　　

生理pH过渡驱动的蛋白冠动态调控机制

1 引言

纳米药物在临床转化中面临生物身份识别的核心挑战。当纳米颗粒（NPs）进入体内，血浆蛋白会立即吸附形成"蛋白冠"（PC），完全覆盖其原始化学特性。特别值得注意的是，PC会随着纳米颗粒穿越不同微环境（如血液pH 7.4→肿瘤组织pH 6.5→溶酶体pH 4.5-5.5）而发生动态演变，这种演变直接影响纳米颗粒的生物分布和治疗效果。酸性pH作为肿瘤微环境的标志性特征，能显著改变蛋白质电荷分布和构象，但目前关于pH介导的PC演化及其生物学效应仍缺乏系统研究。

2 结果与讨论

2.1 SMNs和PC@SMNs的制备与表征

通过反向微乳液法合成的二氧化硅包覆磁性纳米颗粒（SMNs）具有均匀的球形结构，核心尺寸约50 nm（TEM），水合直径134 nm（DLS）。在模拟血液环境的pH 7.4条件下形成预蛋白冠（Pre-PC@SMNs）后，再暴露于不同pH环境。酸性条件（pH 5.0）使PC@SMNs的水合直径增至180 nm，zeta电位升至-3.0 mV，蛋白吸附量显著增加（BCA测定）。SDS-PAGE显示酸性环境使100 kDa和25-35 kDa蛋白条带增强，而10 kDa条带减弱，提示pH依赖的PC组成变化。

2.2 不同pH下PC组成的LC-MS/MS分析

质谱分析揭示pH 5.0条件下PC呈现独特指纹图谱：脂蛋白（ApoA1/ApoE/ApoB）含量增加1.5倍，补体蛋白C3下降40%，免疫球蛋白减少35%，而调节蛋白C4BPA上升2.2倍。GO分析显示差异蛋白显著富集于补体激活和胆固醇代谢通路。这种"酸性PC特征"可能与蛋白质等电点（pI）相关——当环境pH接近蛋白质pI时，净电荷减少会增强蛋白-NP相互作用。

2.3 SMN-HSA相互作用的pH依赖性

以人血清白蛋白（HSA）为模型，多种光谱技术揭示酸性环境增强SMN-HSA相互作用：荧光猝灭实验显示pH 5.0时结合常数K_ass达1.2×10⁵ L/mol，结合位点数n增至1.8。CD光谱表明相互作用使HSA的α-螺旋含量从72%降至60%，β-折叠从3%增至7%，提示酸性pH诱导的蛋白解折叠暴露出更多疏水核心区域。

2.4 细胞摄取行为的pH调控

流式细胞术显示PC@SMNs在pH 5.0时的细胞摄取量较pH 7.4提高2.1倍（RAW264.7）和1.8倍（A549）。共聚焦显微镜观察到酸性PC@SMNs在巨噬细胞中与溶酶体共定位系数r=0.82，而在A549细胞中呈现膜粘附特征。Pearson相关性分析发现C4BPA与巨噬细胞摄取的相关系数达0.9999，而ApoB与dTHP-1细胞摄取高度相关（r=1.000）。

2.5 内吞机制的重编程

抑制剂实验揭示pH 7.4时PC@SMNs主要通过网格蛋白（clathrin）介导内吞，而pH 5.0时则激活多通路协同摄取：dynasore（发动蛋白抑制剂）使RAW264.7摄取降低63%，EIPA（巨胞饮抑制剂）降低47%。竞争性阻断实验证实酸性PC优先被清道夫受体SR-A1和LDLR识别，这与变性HSA暴露的结合域直接相关。

2.6 炎症反应的 paradoxical 调控

尽管酸性PC促进细胞摄取，但dTHP-1细胞的炎症指标却显著降低：pH 5.0组的ROS水平仅为pH 7.4组的45%，IL-6分泌量下降62%。ELISA检测显示这种"高摄取-低炎症"现象与PC中C3减少和C4BPA增加相关，后者可通过抑制补体级联反应减弱NF-κB信号通路激活。

3 结论

本研究建立了"pH-PC指纹-生物学行为"的定量关系框架，证明微环境pH通过双重机制调控纳米药物命运：① 改变PC组成（如增加ApoE/C4BPA，减少C3）；② 诱导蛋白构象变化（如HSA解折叠）。这种机制为设计肿瘤选择性纳米药物提供了新思路——利用酸性PC的"隐形"特性（减少免疫清除）和增强的肿瘤细胞摄取能力，可显著提高靶向效率。该发现对炎症性疾病和代谢紊乱（如糖尿病酮症酸中毒）伴随的pH异常也具有重要启示意义。

4 实验方法

研究采用标准化的纳米颗粒表征技术（TEM/DLS/nanoFCM）、蛋白质组学（LC-MS/MS）、光谱分析（荧光/UV/CD）和多维度细胞评估系统（流式/共聚焦/ELISA）。所有细胞实验均设三重生物学重复，统计显著性通过ANOVA检验（p<0.05，*p<0.01）。实验方案经中国海洋大学伦理委员会批准（OUC-HM-2022-01）。