基于侧向流动试纸条的mRNA疫苗现场质量控制技术：去中心化生产中的全面解决方案

本文开发了一种创新的侧向流动试纸条检测法（LFSA），用于mRNA疫苗关键质量属性的现场快速检测。该技术通过荧光纳米颗粒标记抗体和聚脱氧胸苷酸（poly(dT25)）探针同步检测5'帽结构和poly(A)尾，可在15分钟内完成mRNA加帽效率、完整性和脂质纳米颗粒（LNPs）封装效率的序列非依赖性分析，为资源有限地区的去中心化生产提供了高灵敏度（检测限1.94 ng/μL）、低成本（CV<10%）的质控方案。

　　

1 引言

mRNA技术的快速发展对疫苗质量控制提出新挑战。传统方法如液相色谱-质谱（LC-MS）和毛细管电泳（CE）依赖昂贵设备和专业操作，难以适应去中心化生产场景。本研究开发的LFSA技术突破性地整合了抗7-甲基鸟苷（m⁷G）抗体的荧光纳米颗粒与poly(dT₂₅)捕获探针，形成双信号检测体系，可特异性识别同时具备5'帽和poly(A)尾的完整mRNA分子。

2 结果

2.1 LFSA设计与优化

通过调整缓冲液成分（0.2% NP40+3% NaCl+2%甲酰胺）将信噪比提升5倍。实验证明，mRNA长度（771-4407 nt）、化学修饰（Ψ/m¹Ψ/m⁵C）和加帽方式（共转录/酶促加帽）对检测准确性影响<5%，但核苷酸修饰对信号强度的影响显著高于帽结构变异。

2.2 加帽效率分析

结合RNA 5'多磷酸酶处理建立参比体系，LFSA与LC-MS结果高度一致（R²>0.98）。在四种厂商提供的Fluc mRNA盲测中，均准确检出>95%的加帽效率，而LC-MS因需序列特异性探针无法实现该功能。

2.3 完整性监测

通过三步纯化获得≈100%完整mRNA参比品。加速降解实验显示，LFSA能区分70℃处理1h后的降解产物，其检测限（1.94 ng/μL）虽略高于CE（0.54 ng/μL），但可定量分析Cas9长链mRNA（4407 nt），这是凝胶电泳难以实现的。

2.4 LNP封装评估

相比RiboGreen法（无法区分完整/降解mRNA），LFSA特异性显示：当LNP中完整mRNA比例从100%降至0%时，检测到的有效封装剂量相应线性下降（R²=0.997）。动物实验证实，仅含20%完整mRNA的LNP制剂其荧光素酶活性降低82%。

2.5 现场质控应用

在模拟运输实验中，LNP-mRNA于37℃储存2周后完整性下降35%，此时DLS显示粒径增加12 nm，与体内表达活性损失程度高度吻合。该结果证实LFSA可实时预警疫苗效价衰减。

3 讨论

LFSA的创新性体现在：

1）首次实现单次检测同时评估三项关键参数；

2）较LC-MS节省99%样本量（100 ng vs 100 pmol）；

3）操作培训仅需5分钟，适合基层应用。未来需优化针对聚合物载体（如PLGA）的mRNA释放方案，并建立长链RNA标准品体系以提升定量精度。

4 实验方法

关键步骤包括：

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  羧基化荧光纳米颗粒与m⁷G抗体的EDC/NHS偶联

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  链霉亲和素修饰的poly(dT₂₅)在硝酸纤维素膜上形成T线

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  SM-102脂质体通过微流控混合器（流速比1:3）封装mRNA

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  Triton X-100（0.2%）处理LNP后，通过标准曲线计算有效封装剂量