高度有序DNA框架界面实现高效酶促寡核苷酸合成新突破

这篇研究论文创新性地开发了基于三维DNA框架（TDN）的纳米界面，显著提升了酶促寡核苷酸合成（EOS）的效率与准确性。通过构建四面体DNA纳米结构（TDN）作为刚性支架，实现了引物的有序直立排列与合理间距，使酶（E-ZaTdT）对底物（dNTP-3′-ONH2）的亲和力（Km降低42.94%）和催化效率（kcat/Km提升94.51%）显著优化。研究成功合成60-nt DNA片段（单步产率96.82%），并应用于15字节文本信息的精准存储，为DNA信息存储和基因研究提供了新范式。

　　

高度有序DNA框架界面实现高效酶促寡核苷酸合成

Abstract

酶促寡核苷酸合成（EOS）因其长链合成能力、操作简便和环境友好等优势，成为化学合成法的潜在替代方案。然而，酶与引物在固液界面的可及性限制导致合成错误率居高不下。本研究通过构建四面体DNA纳米结构（TDN）功能化界面，首次实现了引物的纳米级空间有序排列，为高效EOS提供了全新解决方案。

1 Introduction

传统磷酰胺化学法合成DNA面临链长限制、高成本和环境污染等问题。EOS依赖终端脱氧核苷酸转移酶（TdT）催化3′-封闭核苷酸（dNTP-3′-ONH₂）的聚合，但固相合成中引物的各向异性和酶的空间位阻严重制约效率。TDN凭借其5.8 nm的精确尺寸和刚性结构，可定向排列引物并维持≈5.2 nm间距，为酶-底物相互作用创造理想微环境。

2 Results

2.1 Initiator-TDN的组装与表征

通过55-nt链（Int-A/B/C/D）的热退火一步法自组装TDN，Native PAGE显示组装效率超80%。PDMS界面经MPTS/GMBS修饰后，荧光定量证实4 μM修饰浓度下，TDN、单链（SS）和双链（DS）支架的引物负载量相当，确保后续实验可比性。

2.2 EOS效率定量分析

创新性采用焦磷酸（PPi）生物发光法监测合成过程，线性范围1-10 μM（R²=0.9956），回收率96.7%-102.1%。优化后确定最佳条件：40°C、0.63 mM Co²⁺、0.01% Triton X-100。

2.3 不同支架的酶促动力学比较

Michaelis-Menten模型显示，TDN支架使dTTP-3′-ONH₂的K_m值较SS降低42.94%，k_cat/K_m提升94.51%。FRET分析进一步证实，TDN在1分钟时的能量转移效率（58.68%）显著高于SS（28.33%）和DS（36.59%）。

2.4 TDN支架提升界面EOS效率

9-nt序列（GCTGCTGCT）合成中，TDN实现96.97%单步产率（全长产率75.83%），较SS（93.89%）显著提升。对发夹结构（ΔG=-7.10）、同聚物（CCC/TTTTTT）和高GC含量（80%）序列的合成中，TDN将缺失错误率从SS的8.47%降至3.05%。

2.5 基于TDN-EOS的DNA信息存储

将"陈嘉庚"15字节文本编码为60-nt DNA序列，通过60循环EOS实现96.82%单步产率，NGS解码准确率100%。TDN在60次循环后仍保持结构完整性（FRET效率变化<5%）。

3 Discussion

TDN生产可通过噬菌体-DNAzyme系统降低成本，当前实验室规模组装纯度已达96.8%。该策略将DNA框架从传统生物识别拓展至生物制造领域，为基因组合成和DNA存储奠定基础。

4 Conclusion

TDN支架通过精确控制引物空间排列，使EOS单步产率突破96%，为开发新一代DNA合成技术提供了范式转换。

5 Experimental Section

关键实验包括：TDN组装（TM缓冲液，95°C→4°C退火）、PDMS界面修饰（MPTS/GMBS共价偶联）、PPi生物发光检测（含ATP硫酰酶/荧光素酶体系）、NGS数据分析（Python脚本进行错误分类与产率计算）。统计采用GraphPad Prism进行ANOVA和t检验（*p<0.001）。