水稻OsNRT1.1B-OsCNGC14/16-Ca2+-OsNLP3通路：磷酸化介导的氮稳态维持机制及其农业应用价值

（编辑推荐）本研究首次揭示水稻中OsNRT1.1B-OsCNGC14/16-Ca2+通路与经典泛素化途径协同调控氮响应的分子机制，阐明钙信号通过磷酸化OsNLP3（Ser193）加速其核转位，实现短期（PNR）与长期氮利用的整合，为作物氮效率（NUE）提升提供新靶点。

　　

1 引言

氮素利用效率（NUE）是作物生产的核心挑战。水稻作为主要粮食作物，其氮信号通路与拟南芥存在显著分化：拟南芥依赖AtNRT1.1-Ca²⁺-CPKs-AtNLP7级联，而水稻已知的OsNRT1.1B-OsNBIP1-OsSPX4-OsNLP3泛素化通路无法解释其快速响应特性。本文发现OsNRT1.1B与环核苷酸门控通道OsCNGC14/16形成质膜复合体，介导硝酸盐触发的钙内流，通过磷酸化OsNLP3第193位丝氨酸（Ser193）协调短期信号与长期代谢适应。

2 结果

2.1 钙信号通路与泛素化级联的互补性

时间进程实验显示，硝酸盐诱导的基因表达呈双峰曲线：1小时初级响应峰（PNR）和4-5小时次级峰。OsNRT1.1B缺失完全消除双峰，而OsNBIP1突变仅阻断PNR，暗示存在独立通路。钙成像证实OsNRT1.1B是硝酸盐触发Ca²⁺振荡的必要条件，钙通道抑制剂La³⁺可抑制野生型中OsNIA等基因的快速诱导。

2.2 OsCNGC14/16-OsNRT1.1B复合体的通道特性

酵母双杂交筛选发现OsCNGC14/16与OsNRT1.1B互作，共定位于根尖质膜。TEVC记录显示，OsCNGC14/16异源二聚体在爪蟾卵母细胞中产生Ca²⁺电流，而OsNRT1.1B共表达抑制该活性；硝酸盐处理可解除抑制，表明其构成"受体-通道"转换体。¹⁵N吸收实验证实OsCNGCs不参与硝酸盐转运，专司钙信号传导。

2.3 钙信号缺失的表型后果

CRISPR构建的oscngc14/16突变体根尖Ca²⁺响应消失，但NaCl诱导信号保留，体现通道特异性。田间试验显示，突变体在低氮条件下株高、分蘖数和产量显著降低，而OsSPX4过表达株系表型轻微，证实钙通路独立调控长期适应。

2.4 OsNLP3磷酸化的功能解析

Phos-tag电泳发现硝酸盐通过Ca²⁺依赖方式磷酸化OsNLP3，保守位点Ser193的拟磷酸化突变体（S193D）核转位速度较野生型快1倍，且自激活其启动子能力增强。值得注意的是，磷酸化缺陷体（S193A）仍保留部分活性，与拟南芥AtNLP7的绝对依赖性形成鲜明对比，反映水稻调控的冗余性。

3 讨论

该研究构建了水稻氮信号的双轨模型：

1）快速响应轨：OsNRT1.1B-OsCNGC14/16-Ca²⁺-OsNLP3磷酸化级联在秒级启动信号；

2）稳态调节轨：OsNRT1.1B-OsNBIP1-OsSPX4泛素化降解提供小时级精细调控。

这种双系统可能解释水稻对波动氮环境的独特适应性。OsCNGC14/16同时参与ABA和低温响应，暗示其作为环境整合节点的进化意义。

4 实验方法

研究采用CRISPR-Cas9构建突变体，结合活细胞钙成像（YC3.6传感器）、TEVC电生理、Phos-tag蛋白质修饰分析等技术。田间试验在中国海南和北京进行，涵盖低氮（0.5 kg N/100m²）与常氮（1 kg N/100m²）处理，通过¹⁵N同位素示踪量化氮吸收效率。

（注：全文严格遵循原文数据，未添加非文献支持内容）