基于萘-2-乙酰胺骨架的Keap1-Nrf2蛋白互作抑制剂开发及其抗炎作用机制研究

这篇研究报道了新型吡咯烷型萘-2-乙酰胺化合物5i通过特异性结合Keap1-DC结构域，有效抑制Keap1-Nrf2蛋白互作（PPI），激活细胞内Nrf2信号通路并诱导HO-1、NQO1等靶基因表达。该化合物在LPS刺激的巨噬细胞中展现出显著抗炎效果，为开发非共价型Nrf2激活剂治疗炎症性疾病提供了新思路。

　　

1 引言

生物体持续暴露于活性氧（ROS）等有害因素中，Keap1-Nrf2系统作为进化保守的防御机制，通过调控多种细胞保护蛋白表达维持内稳态。Nrf2作为转录因子，其活性受Keap1调控——在稳态条件下，Keap1通过ETGE和DLG基序介导Nrf2的泛素化降解；而在应激状态下，Keap1特定半胱氨酸残基的修饰会阻断这一过程，导致Nrf2积累并激活下游抗氧化反应元件（ARE）驱动的基因表达。

近年来，靶向Nrf2的药物开发聚焦于两类策略：含迈克尔受体基团的共价修饰剂（如CDDO-Me）和非共价蛋白互作抑制剂。萘-1,4-双(4-甲氧基苯磺酰胺)（Cpd16）作为经典PPI抑制剂，通过与Keap1的DC结构域结合发挥作用。本研究团队前期开发的K67等萘衍生物显示出p62-Keap1/Nrf2-Keap1双重抑制活性，而2位取代的N,N-二甲基乙酰胺结构更展现出强效Nrf2激活能力，这为结构优化提供了重要线索。

2 结果与讨论

2.1 设计与合成

通过六步反应构建了含环状结构的萘-2-乙酰胺衍生物库（5a-5k）。关键步骤包括：1,4-二氨基萘与4-乙氧基苯磺酰氯缩合，CAN氧化形成醌亚胺中间体，再经丙二酸二甲酯加成及脱羧反应生成乙酸衍生物，最后与不同胺类缩合形成目标化合物。

2.2 细胞内Nrf2激活筛选

在HEK293-ARE-Luc报告系统中，吡咯烷型衍生物5i表现出最强活性（13倍激活），显著优于阳性对照tBHQ（10倍）。值得注意的是，环状三级酰胺（5i-5k）普遍优于二级酰胺，而苯基取代衍生物5h完全失活，表明空间位阻显著影响活性。细胞毒性实验证实所有化合物在50 μM下均无显著毒性。

2.3 FP结合实验

尽管5i在荧光偏振（FP）实验中IC₅₀为1.07 μM，但其细胞活性与结合亲和力未呈现线性相关。ClogP计算显示亲脂性并非决定活性的唯一因素，提示乙酰胺侧链对细胞穿透性具有特殊贡献。

2.4 晶体结构解析

1.8 ?分辨率的X射线晶体结构（PDB 9UO8）揭示：5i的萘环嵌入Keap1-DC中央孔隙，与Arg415形成π-阳离子堆积；两个乙氧基苯磺酰胺分别与Tyr525 π-π堆积、与Ser508/Ser602氢键结合。有趣的是，吡咯烷侧链呈现双向结合模式，其羰基氧通过水分子与Ser555形成间接氢键，这种柔性相互作用为后续优化提供了结构基础。

2.5 Nrf2靶基因诱导

在RAW264.7细胞中，5i呈浓度依赖性促进Nrf2核积累（8 h处理）。HO-1 mRNA在12.5 μM达峰后下降，而NQO1表达持续升高（50倍），这种差异调控可能与基因启动子区ARE元件的异质性有关。

2.6 抗炎效应

LPS刺激模型中，5i剂量依赖性地抑制NO生成（Griess法）及iNOS表达（RT-PCR）。ELISA检测显示其可降低TNF-α和CCL2分泌，这种多靶点抑制效应可能源于Nrf2与NF-κB通路的交叉调控，包括ROS清除和CBP竞争等机制。

2.7 ADME特性

尽管5i膜渗透性良好（PAMPA 3.06×10^-6 cm/s），但其PBS溶解度（2.65 μM）和代谢稳定性（人肝微粒体清除率546 mL/min/kg）亟待改善。血浆蛋白结合率>96%的特性提示可能需要结构修饰以提升游离药物浓度。

3 结论

本研究证实吡咯烷型萘-2-乙酰胺5i通过独特的三维相互作用抑制Keap1-Nrf2 PPI，其优异的细胞活性和抗炎效果为开发新一代Nrf2靶向药物奠定基础。未来研究将聚焦于提高溶解性（如引入杂原子）和代谢稳定性，推动该先导化合物向临床转化。