活性丝素蛋白水凝胶搭载骨髓间充质干细胞外泌体调控椎间盘退变炎症微环境的研究

本研究创新性地构建了负载mRNA工程化骨髓间充质干细胞外泌体（BMSCs-EVs）的丝素蛋白（SF）水凝胶递送系统，通过调控巨噬细胞M1/M2极化平衡（CCR7+/CD206+）改善椎间盘退变（IVDD）炎症微环境。实验证实SF/EVs复合物能持续释放富含S100B mRNA的功能性EVs，显著抑制促炎因子（iNOS/IL-6）并促进抗炎因子（Arg-1/IL-10）表达，为IVDD的靶向治疗提供了新策略。

　　

3.1 巨噬细胞对BMSCs-EVs的内吞作用

研究团队首先从6周龄C57BL/6小鼠中分离骨髓间充质干细胞（BMSCs），经三系分化鉴定（油红O/茜素红/阿利新蓝染色）和流式表型分析（CD29⁺CD90⁺CD45^-）确认其干细胞特性。透射电镜显示提取的外泌体（BMSCs-EVs）呈典型杯状结构（30-120nm），Western blot验证其携带CD63/CD81/TSG101标志物而缺失Calnexin。通过PKH26荧光标记证实RAW 264.7巨噬细胞可高效内化EVs，为后续免疫调控研究奠定基础。

3.2 SF/EVs复合水凝胶的构建与表征

采用碳酸锂溶解家蚕丝素制备4% SF溶液，经超声诱导凝胶化后负载EVs（11mg/mL）。流变学测试显示复合水凝胶储能模量（G′）高于损耗模量（G″），傅里叶红外光谱（FTIR）中酰胺I带位移至1626cm^-1证实β-片层形成。扫描电镜观察到EVs均匀分布在多孔网络结构中，体外缓释实验显示31天累计释放率达85%。该体系兼具机械强度（平均G′ 1200Pa）与生物相容性（CCK-8显示细胞存活率>95%）。

3.3 巨噬细胞极化的双向调控

在LPS诱导的M1极化模型中，SF/EVs处理使CCR7⁺细胞比例降低62%，CD206⁺细胞增加2.3倍（流式数据）。免疫荧光显示iNOS荧光强度下降78%而CD206上升210%，Western blot检测到IL-6蛋白表达下调而IL-10上调。将条件培养基（CM）作用于髓核细胞（NPCs）后，SF/EVs-CM组MMP3/13 mRNA表达量仅为PBS组的30%，证实其通过免疫微环境重塑保护细胞外基质。

3.4 S100B的关键机制解析

高通量测序筛选出13个巨噬细胞相关差异基因（如Clec4e/IL1R1），其中S100B mRNA在SF/EVs组显著上调。通过慢病毒构建S100B敲低（sh-S100B-1）和过表达（oe-S100B）BMSCs，发现EVs主要通过递送S100B mRNA而非蛋白发挥作用。动物实验显示，SF/EVs-oe-S100B组椎间盘高度指数（DHI）恢复至 sham组的82%，Pfirrmann评分改善2级，组织学显示髓核结构完整且iNOS⁺巨噬细胞浸润减少67%。

4 讨论与展望

该研究首次将mRNA工程化EVs与SF水凝胶结合，通过S100B-RAGE/STAT3通路调控巨噬细胞表型。相较于传统胶原支架，SF的β-片层结构提供更稳定缓释性能；而相较于miRNA调控策略，mRNA修饰可实现更精准的时序控制。未来需在灵长类模型中验证其力学适应性，并优化EVs的靶向修饰以提升临床转化潜力。