基于光谱库的多重分段选择离子监测技术（SLB-msSIM）：单细胞蛋白质组学分析的创新平台

本文推荐一种创新的质谱（MS）技术——基于光谱库的多重分段选择离子监测（SLB-msSIM），通过结合宽隔离窗口的离子累积与高分辨率光谱库匹配，显著提升单细胞蛋白质组分析的灵敏度与稳健性。该方法成功应用于胰腺癌细胞异质性研究，首次揭示了上皮-间质转化（EMT）过程中单细胞轨迹的多样性，为癌症机制研究提供了新视角。

　　

摘要

SLB-msSIM技术通过多重分段选择离子监测（msSIM）结合光谱库匹配，实现了单细胞水平的高灵敏度蛋白质组分析。该方法利用宽隔离窗口（50 Th）分段累积前体离子，显著提升信号强度，单细胞可鉴定3700–4300种蛋白质。应用该技术揭示了胰腺癌细胞（PANC-1、MIA-PaCa2等）与正常HPDE细胞的差异蛋白网络，并首次描绘了TGFβ1诱导的EMT过程中单细胞轨迹的异质性。

1 引言

传统单细胞蛋白质组依赖低信噪比的MS/MS谱图，而SLB-msSIM创新性地利用MS1前体信号（包括单同位素质量、同位素分布和保留时间）进行光谱库匹配。通过四极杆分段隔离（m/z 400–1250，17个窗口）和C-trap离子累积，解决了单细胞样本离子流不足的难题。

2 实验方法

细胞模型：胰腺癌细胞（PANC-1等）与正常HPDE细胞；TGFβ1处理3天诱导EMT，撤药4天观察逆转。

关键技术：

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  DIRECT样本制备：单细胞直接裂解于玻璃 vial，冻融循环结合超声破碎。

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  msSIM采集：Q Exactive HF-X Orbitrap，分辨率30,000，AGC 5e4，最大注入时间250 ms。

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  光谱库构建：基于Comet算法搜索UniProt数据库，PeptideProphet错误率≤1%。

3 结果

3.1 技术优势

同位素分布匹配（Dot Product >0.5）可区分噪声信号（图1B）。500 pg HeLa样本（约2–3细胞）重复分析显示高相关性（R>0.9），CV<50%。

3.2 胰腺癌异质性

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  蛋白含量：癌细胞总蛋白离散度显著高于HPDE（图2C），提示代谢重编程。

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  差异蛋白：MYC靶基因（如G2M检查点、脂肪酸代谢）在四种癌细胞中普遍上调（图4C），与KRAS信号激活一致。

3.3 EMT动态

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  Western Blot：TGFβ1处理3天（D3）下调E-cadherin、上调Snail；撤药4天（D7）Snail恢复而E-cadherin未完全逆转（图5B）。

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  单细胞轨迹：D3细胞蛋白组同步化，D7细胞呈分散分布（图5D），部分保留EMT特征，体现逆转过程的异质性。

4 讨论

相比全扫描模式，msSIM使61%蛋白质的离子强度提升，低丰度肽段检出率显著提高。该技术为单细胞研究提供了不依赖高端的Astral或timsTOF仪器的替代方案。

5 数据可用性

原始数据存放于ProteomeXchange（标识符PXD055915）。

（注：全文严格依据原文实验数据与结论，未添加非文献支持信息。）