Chi-Nan沉香种质倍半萜合酶基因AsSS15的分子克隆与原核表达揭示其诱导特性及在倍半萜生物合成中的关键作用

本研究针对Chi-Nan沉香种质（Aquilaria sinensis）中倍半萜合成机制展开，通过克隆倍半萜合酶基因AsSS15（1812 bp），发现其在茎和根中高表达且受机械损伤显著诱导。研究人员成功实现AsSS15的原核表达，证实其催化法尼基焦磷酸（FPP）生成橙花叔醇（nerolidol）的功能，首次阐明Chi-Nan种质倍半萜合成的分子基础，为沉香品质改良提供理论依据。

　　

沉香作为一种珍贵的传统中药材和香料，其核心成分倍半萜类化合物的形成机制一直是研究热点。Chi-Nan种质作为Aquilaria sinensis的新化学型，具有树脂含量高、倍半萜多样性丰富等特点，但其分子机制尚未阐明。这项发表在《Physiology and Molecular Biology of Plants》的研究，首次从Chi-Nan种质中克隆出关键倍半萜合酶基因AsSS15，揭示了其在沉香形成中的核心作用。

研究团队采用机械损伤诱导Chi-Nan种质枝条，通过转录组分析锁定差异表达的AsSS15基因。利用PCR扩增获得全长1812 bp的编码序列，生物信息学预测显示其编码603个氨基酸，含典型TPS家族保守基序RRX₈W和DDxxD。qRT-PCR分析发现AsSS15在茎部表达量最高，机械损伤可使其表达提升近百倍，显著高于普通沉香种质。通过原核表达系统获得重组蛋白，体外酶活实验证实其能将FPP催化为橙花叔醇（GC-MS验证），比活力达3.989 U/mg。

主要技术方法

1. 1.

   基于转录组数据筛选目标基因，设计特异性引物克隆AsSS15全长CDS

2. 2.

   采用qRT-PCR分析基因组织特异性及创伤诱导表达模式（以GAPDH为内参）

3. 3.

   构建pCzn1原核表达载体，优化密码子后在E. coli BL21(DE3)中诱导表达

4. 4.

   通过SDS-PAGE和Western blot（抗His标签抗体）验证重组蛋白

5. 5.

   体外酶活测定体系（含FPP底物）结合SPME-GC-MS鉴定产物

研究结果

1. 1.

   AsSS15基因克隆与生物信息学分析

   从受伤枝条中克隆的AsSS15编码典型倍半萜合酶，系统进化显示与菊科（Artemisia annua）等植物TPS聚簇。三级结构建模（模板4rnq.1.A）显示42.19%相似度，QMEANDisCo评分0.74±0.05。

2. 2.

   表达特性分析

   茎部表达量是叶片的5.2倍，创伤后Chi-Nan种质表达量较普通种质提高97.3倍（p<0.01），表明其参与创伤响应。

3. 3.

   蛋白功能验证

   

   GC-MS检测到特征峰（15.907 min）与nerolidol标准品匹配（m/z 69,93,161），证实催化活性。

结论与意义

该研究首次阐明AsSS15通过催化FPP生成nerolidol参与Chi-Nan沉香倍半萜合成，其创伤诱导高表达特性与树脂快速形成相关。成果不仅完善了沉香次生代谢理论，更为分子育种提供了靶点基因。作者Zhenghan Bao等强调，后续需探究AsSS15与其他TPS基因的协同作用，以解析Chi-Nan种质独特代谢网络的调控机制。