细胞毒性CD4+T细胞在黑色素瘤免疫治疗耐药中的免疫抑制转变机制研究

本研究针对PD-1/CTLA-4抑制剂治疗中黑色素瘤患者的耐药机制，通过单细胞转录组分析揭示了细胞毒性CD4+T细胞从激活态向耗竭态（TIGIT+/CTLA-4+）及Treg样表型（FOXP3+）的动态转变过程。研究发现非应答者（NR）中CD4+T细胞表现出GZMB+与PDCD1+共表达特征，并通过轨迹分析证实其向免疫抑制状态的转化，为克服免疫治疗耐药提供了新靶点。

　　

免疫检查点抑制剂（CPIs）革命性地改变了癌症治疗格局，但黑色素瘤患者中仍有相当比例对PD-1/CTLA-4靶向治疗无应答。传统研究聚焦于CD8⁺T细胞耗竭，而CD4⁺T细胞亚群——尤其是具有细胞毒性的CD4⁺T细胞——在治疗响应中的作用长期被忽视。这些特殊亚群既能通过MHC II类限制性机制直接杀伤肿瘤，又表现出与CD8⁺T细胞相似的耗竭特征，其功能状态转变可能是免疫逃逸的关键环节。

为解析这一机制，Heekyong R. Bae团队利用已发表的黑色素瘤单细胞数据集（GSE120575），对32例接受CPIs治疗患者的16,291个免疫细胞进行深度分析。通过排除增殖性T细胞和经典FOXP3⁺Tregs，聚焦3,341个常规CD4⁺T细胞的转录组特征，结合应答者（R）与非应答者（NR）的对比分析，揭示了细胞毒性CD4⁺T细胞在治疗抵抗中的核心作用。

关键技术方法

研究采用TISCH数据库预处理的scRNA-seq数据，使用Scanpy和scVI-tools进行质控（过滤线粒体基因>10%的细胞）、标准化和基于Leiden算法的聚类分析。通过UMAP可视化细胞亚群，Wilcoxon检验鉴定差异表达基因（DEGs），GSEApy进行通路富集分析（Hallmark和C2基因集）。动态轨迹推断采用转录组相似性构建，样本来源于16个R和16个NR患者的病灶活检。

分类与分布特征

通过排除CD8⁺T细胞和Tregs，研究鉴定出9个CD4⁺T细胞亚群。关键发现包括：

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  簇6（NR富集）高表达GZMB、NKG7等细胞毒性标记，同时携带PDCD1、TIGIT等耗竭标志

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  簇0（NR特异性）呈现FOXP3、CTLA4高表达的Treg样特征

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  簇8（R特异性）富含CXCR4⁺记忆样表型

功能表型转换

转录组分析显示：

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  簇2/6（细胞毒性）与簇7（耗竭）共享T细胞激活通路抑制特征

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  簇7与Treg样簇0存在基因表达连续性，提示表型转化

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  轨迹分析揭示簇4→簇6→簇0的演化路径，证实NR中细胞毒性CD4⁺T细胞向免疫抑制状态转分化

机制与验证

在独立乳腺癌数据集（GSE176078）中同样观察到：

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  簇13（细胞毒性）与簇5（Treg样）的空间邻近性

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  HLA-DRA⁺与耗竭标记共表达模式，提示MHC II类分子异常表达可能驱动功能失调

研究结论

该研究首次系统描绘了细胞毒性CD4⁺T细胞在CPI治疗中的动态演变：

1. 1.

   NR患者中该亚群通过获得PD-1⁺/CTLA-4⁺耗竭表型，丧失肿瘤杀伤能力

2. 2.

   转录组证据支持其进一步转化为FOXP3^low Treg样细胞，加剧免疫抑制微环境

3. 3.

   HLA II类分子异常表达可能是表型转化的关键驱动因素

这项发表于《Cancer Immunology, Immunotherapy》的工作，不仅为免疫治疗耐药提供了新的生物标志物（如簇6/簇0比例），更提出了靶向CD4⁺T细胞可塑性以增强疗效的治疗策略。未来需通过TCR克隆追踪和功能性实验验证这些细胞的直接抗肿瘤活性，但其转录组框架已为克服免疫治疗瓶颈提供了全新视角。