鸡鸭气管环与肺组织冷冻保存技术的优化及其在禽流感病毒快速表型鉴定中的应用

为解决禽流感病毒(AIVs)表型鉴定中动物模型成本高、周期长的问题，研究人员优化了鸡鸭气管器官培养物(TOCs)和精密切割肺切片(PCLS)的冷冻保存技术。通过添加海藻糖的二甲基亚砜(DMSO)冷冻保护液，显著提高了组织存活率。结果表明，冷冻保存的呼吸道组织能有效区分H5N1和H9N2病毒的宿主适应性差异，为禽流感防控提供了标准化离体研究平台。

　　

禽流感病毒（AIVs）的持续变异对全球家禽业和公共卫生构成重大威胁。自1996年高致病性H5N1病毒（Gs/Gd谱系）出现以来，其通过基因重组不断演化，导致2020-2021年全球禽流感大流行。传统动物模型存在伦理、成本和时效性限制，而新鲜离体组织模型又面临保存期短、供体获取困难等问题。如何建立稳定、可重复的病毒表型鉴定平台，成为当前研究的核心挑战。

为应对这一挑战，Alessandra Napolitan团队在《Journal of Virological Methods》发表研究，开发了基于冷冻保存的鸡鸭呼吸道组织模型。研究采用特异性无病原体（SPF）白来航鸡和番鸭，通过组织切片机制备气管环（0.4 mm）和肺切片（250 μm），比较了含海藻糖的DMSO冷冻液效果。关键实验包括：组织活力检测（Alamar Blue法）、病毒复制动力学（TCID₅₀测定）、组织学分析（H&E染色）和免疫组化（抗A型核蛋白抗体）。

3.1 TOCs和PCLS培养与感染优化

研究发现39°C培养显著提高鸡气管环（cTOCs）活力，而3 μL接种量可实现高效病毒感染。在肺切片（cPCLS）中，250 μm厚度和DMEM培养基组合最优，H10N1病毒在41°C复制更活跃。

3.2 冷冻保存后组织完整性

含10% DMSO+20%胎牛血清（FBS）+0.1 mol/L海藻糖的S1溶液使冷冻cTOCs保持纤毛运动，但冷冻组织活力较新鲜组降低36.16%。组织学显示冷冻cTOCs上皮排列紊乱，但假复层结构完整；肺切片则呈现毛细血管核溶解等损伤。

3.3 病毒易感性差异

冷冻使cTOCs和cPCLS对H10N1的半数感染剂量（ID₅₀）分别增加5.25倍和5.32倍，但病毒产量不受冷冻时间（最长60周）影响。免疫组化证实冷冻组织仍保持病毒天然嗜性，H5N1在鸭TOCs中复制优势显著，而H9N2在鸡TOCs中更适应。

这项研究首次建立了禽类呼吸道组织的长期冷冻保存方案，其创新性体现在三方面：一是通过海藻糖增强冷冻保护效果，使组织存活期延长至60周；二是证实冷冻组织能准确反映病毒宿主特异性，如H5N1在鸭源组织的快速复制与自然感染一致；三是为突发疫情提供了即用型研究平台。尽管冷冻组织活力有所下降，但其在病毒复制动力学和细胞嗜性方面的表现与新鲜组织高度一致，为禽流感病毒的快速风险评估提供了重要工具。未来可通过优化培养条件（如气液界面培养）和开发物种特异性冷冻液进一步提升模型性能。