靶向DNA ADP-核糖基化触发细菌模板修复与真核生物碱基突变编辑的新策略

本研究针对传统碱基编辑器( BEs )依赖脱氨酶或糖基化酶的局限性，创新性地利用细菌抗噬菌体毒素DarT2介导的DNA ADP-核糖基化( ADPr )修饰，开发了"附加编辑"( append editing )技术。通过将减毒DarT2与Cas9切口酶融合，实现了细菌中无疤痕同源重组修复和真核细胞中T>A/C的特异性突变，填补了现有碱基编辑器无法实现T>A转换的空白，为基因组编辑提供了全新工具。该成果发表于《Nature Biotechnology》，为病原菌基因治疗和遗传病矫正开辟了新途径。

　　

在基因组编辑领域，传统碱基编辑器( BEs )通过脱氨酶或糖基化酶实现碱基替换，但这类"减法修饰"存在靶向范围有限、编辑类型单一等问题。更关键的是，现有技术难以实现胸腺嘧啶( T )向腺嘌呤( A )的定向转换，而临床数据库显示这类突变可纠正789种致病性单核苷酸变异( SNVs )。与此同时，细菌与噬菌体亿万年的军备竞赛进化出了丰富的DNA修饰系统，其中DarT2/DarG毒素-抗毒素系统能特异性催化DNA的ADP-核糖基化( ADPr )修饰，但这类"加法修饰"在基因编辑中的应用尚未探索。

为解决这些挑战，Darshana Gupta等研究者创新性地将细菌毒素DarT2改造为基因组编辑工具。研究团队首先通过体外实验证实肠致病性大肠杆菌( EPEC ) DarT2能特异性识别5'-TYTN-3'基序，在单链DNA( ssDNA )的胸腺嘧啶N3位添加ADPr基团，并阻碍DNA聚合酶延伸。随后构建了DarT2与切口型ScCas9( nScCas9 )的融合编辑器，通过全基因组测序、流式细胞术等系统评估了其在原核和真核生物中的编辑特性。

关键技术包括：

1. 1.

   采用细胞无表达系统验证DarT2对5'-TCTC-3'基序的特异性ADP-核糖基化

2. 2.

   构建E. coli MG1655 kanR^*报告菌株评估同源重组效率

3. 3.

   通过AlphaFold预测结构指导DarT2减毒突变( M86L/R92A/R193A )

4. 4.

   在HEK293TΔTARG1细胞中利用Illumina NovaSeq分析碱基突变谱

5. 5.

   使用SpRY-Cas9拓展非NGG PAM靶向范围

靶向DNA ADP-核糖基化驱动大肠杆菌模板介导的同源重组

研究发现DarT2^D-nCas9在E. coli中能诱导97%的卡那霉素抗性克隆，显著优于传统Cas9的76%。关键机制在于ADPr修饰触发RecF介导的同源重组( HR )，随后通过核苷酸切除修复( NER )清除修饰。与碱基编辑器不同，该过程不引起可检测的碱基突变，全基因组测序显示其脱靶率极低。

减毒DarT2实现高效灵活的大肠杆菌基因组编辑

通过结构指导的理性设计，获得DarT2^DLAA四突变体( G49D/M86L/R92A/R193A )，在保持编辑效率的同时显著降低细胞毒性。该编辑器可实现91bp大片段替换、100bp插入和多位点同步编辑，在沙门氏菌flgG基因中也验证了普适性。

程序化ADP-核糖基化在酵母和植物中主要驱动碱基突变

在酿酒酵母中，DarT2^DLAA-nScCas9诱导67% T>A和33% T>C突变，与模板修复呈互斥关系。在本氏烟草中，PDS1基因靶向显示59% T>A偏好性，且indels频率比碱基突变低6-80倍，证实真核生物倾向通过跨损伤合成( TLS )而非HR修复ADPr损伤。

人类细胞中TARG1缺失条件下的靶向碱基突变

由于人类细胞存在ADPr水解酶TARG1，仅在HEK293TΔTARG1细胞中观察到16%的T>A/C突变。值得注意的是，5'-TCTN-3'基序产生等比例T>A/C，而5'-TTTN-3'强烈偏好T>A。与胸腺嘧啶糖基化酶碱基编辑器( DAF-TBE )相比，ADPr-TAE具有更精确的单碱基靶向性。

这项研究开创性地将DNA附加修饰转化为基因组编辑工具，其重要意义体现在三方面：首先，在细菌中建立了不依赖碱基替换的编辑范式，可通过同源重组实现大片段改写；其次，在真核生物中实现了独特T>A转换，填补了现有碱基编辑器的技术空白；最后，DarT2的模块化设计为开发其他DNA附加编辑系统提供了蓝图。研究还揭示不同物种对ADPr损伤的修复偏好：原核生物依赖RecF-HR途径，而真核生物采用TLS导致碱基突变，这种差异为理解DNA损伤应答的进化提供了新视角。

未来可通过挖掘更多微生物防御系统( 如噬菌体Mu的Mom修饰 )拓展编辑类型，或联合TARG1抑制剂提升人类细胞编辑效率。该技术为遗传病治疗、农业育种和合成生物学提供了全新工具，特别是针对ATM基因c.7271T>G等临床重要突变。正如研究者所言："附加编辑代表基因组编辑的新范式——不是改变碱基身份，而是通过添加化学基团重编程细胞自身的修复机制。"