Mask蛋白通过诱导闭合构象和生物分子凝聚体隔离维持NF-κB前体失活状态

本研究揭示了果蝇蛋白Mask通过双重机制调控NF-κB家族转录因子Relish活性的创新机制。研究人员发现Mask通过其ANK结构域促进Relish头尾相互作用形成闭合构象，同时通过相分离形成生物分子凝聚体将Relish与切割酶DREDD空间隔离。该调控机制在哺乳动物中部分保守，为NF-κB信号通路的稳态调控提供了新见解，对炎症性疾病治疗策略开发具有重要启示意义。

　　

在生命体抵御病原体入侵的防御系统中，NF-κB（核因子κB）家族转录因子扮演着核心调控角色。这类蛋白的异常激活与多种炎症性疾病和癌症密切相关，因此其活性必须受到精确调控。虽然NF-κB的激活机制已被广泛研究，但关于其前体蛋白在静息状态下如何维持失活状态仍存在知识空白。果蝇中的Relish蛋白作为哺乳动物NF-κB前体p100/p105的同源物，其N端含有Rel同源结构域（RHD），C端则带有IκB样ANK重复结构域，是研究这一问题的理想模型。

研究人员通过免疫沉淀-质谱联用技术（IP-MS）筛选发现，含有多个ANK重复结构的Mask蛋白是Relish的关键负调控因子。遗传学实验证实，mask基因缺失会导致果蝇对革兰氏阴性菌感染的抵抗力增强，抗菌肽表达水平升高；而过表达Mask则表现出相反表型。这些效应完全依赖于Relish，表明Mask特异性调控IMD（免疫缺陷）通路而非Toll通路。

为阐明分子机制，研究团队运用了多种关键技术：通过双分子荧光互补（BiFC）和荧光共振能量转移-荧光寿命成像（FRET-FLIM）技术证实Mask促进Relish形成头尾相互作用的闭合构象；利用活细胞成像和荧光漂白恢复（FRAP）实验证明Mask通过相分离形成动态的生物分子凝聚体；采用位点特异性突变和结构域分析鉴定出Mask中负责相分离的 coiled-coil（CC）和朊病毒样（PLD）结构域；通过构建基因敲除细胞系验证哺乳动物同源蛋白ANKHD1的保守调控功能。

Mask负调控Relish活性

遗传学分析显示，mask突变体果蝇感染革兰氏阴性菌后，Relish靶基因表达显著增强，存活率提高；而Relish缺失可完全消除这些表型。细胞实验证实Mask抑制DREDD介导的Relish切割，但不影响IKKβ介导的磷酸化。

Mask促进Relish闭合构象

结构域定位实验发现，Mask通过其ANK1结构域同时结合Relish的RHD和ANK区域，ANK2结构域则仅结合RHD。删除Relish的SRR1或PEST结构域会破坏其自抑制构象，使切割敏感性增加。FRET-FLIM定量显示Mask显著增强Relish头尾相互作用，使DREDD切割位点D₅₄₅被屏蔽。

Mask形成生物分子凝聚体

高分辨率显微观察发现，Mask通过CC1和PLD2结构域发生液-液相分离，形成具有融合特性和荧光恢复特性的动态凝聚体。这些凝聚体可捕获Relish但排斥DREDD，实现空间隔离。当Mask同时具备构象调控和相分离能力时（如Mask-ACAP），其对Relish的抑制效果最强。

免疫刺激解除Mask抑制

病原体相关分子模式（如cLPS）处理会通过IKKβ依赖性方式减弱Mask-Relish相互作用。同时，活化的DREDD可切割Mask第1771位天冬氨酸，导致凝聚体解体。构建切割位点突变体Mask-D1771A证实，该位点的切割对Relish充分激活至关重要。

哺乳动物中的保守性

在THP-1细胞中敲除ANKHD1导致NF-κB靶基因TNFα和IL-1β表达增强，p100/p105加工增加。虽然哺乳动物ANKRD17不能明显促进p100头尾相互作用，但可通过形成凝聚体隔离p100与加工酶βTrCP，显示调控机制的部分保守性。

这项研究首次揭示了生物分子凝聚体在NF-κB信号调控中的重要作用，提出了"构象调控-空间隔离"的双重抑制模型。Mask通过诱导Relish闭合构象使其保持失活状态，同时通过相分离形成的无膜细胞器将Relish与激活酶DREDD物理隔离，这种双重保险机制确保了静息状态下信号通路的严格调控。该发现不仅深化了对天然免疫应答调控的理解，也为开发靶向相分离过程的抗炎药物提供了新思路。鉴于NF-κB通路在多种疾病中的核心作用，Mask同源蛋白可能成为治疗炎症性疾病和癌症的新靶点。