基于纳米荧光素酶标记的H5N1流感病毒构建及其在抗病毒药物筛选中的应用研究

本研究针对高致病性禽流感病毒H5N1 clade 2.3.4.4b在奶牛和人之间的跨种传播问题，通过基因工程技术构建了表达纳米荧光素酶(Nluc)的重组病毒HPhTX NSs-Nluc。该病毒在保持野生型复制能力的同时，实现了体内外实时追踪感染过程，并成功应用于抗病毒药物巴洛沙韦(BXA)的快速筛选，为H5N1的致病机制研究和药物开发提供了新型工具。研究成果发表于《iScience》。

　　

近年来，高致病性禽流感病毒(HPAIV) H5N1 clade 2.3.4.4b在野生鸟类和家禽中广泛传播，2024年更出现了从奶牛到人的跨种传播案例。这种病毒对哺乳动物（包括人类）的潜在威胁引发了公共卫生担忧。然而，传统病毒检测方法耗时费力，且缺乏实时监测手段，严重制约了对病毒传播机制和抗病毒药物的研究效率。

为突破这些技术瓶颈，Ramya S. Barre、Ahmed Mostafa和Luis Martinez-Sobrido团队在《iScience》发表研究，通过基因重组技术将纳米荧光素酶(Nluc)报告基因插入人源H5N1分离株A/Texas/37/2024的非结构蛋白基因中，成功构建了具有生物发光特性的重组病毒HPhTX NSs-Nluc。该研究采用反向遗传学系统进行病毒拯救，通过多周期生长动力学实验评估病毒复制能力，利用IVIS成像系统进行体内外实时追踪，并建立小鼠感染模型评估病毒致病性。此外，研究还开发了基于Nluc表达的微中和试验方法，用于抗病毒药物筛选。

研究结果显示：

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   HPhTX NSs-Nluc的体外特征：通过将NS1和NEP（核输出蛋白）开放阅读框用PTV-1 2A自剪切序列分隔，成功构建了表达Nluc的病毒株。该病毒在MDCK细胞中表现出与野生型相似的复制动力学和噬斑形态，且能稳定传代10代以上。

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   干扰素抑制功能保留：与野生型病毒类似，HPhTX NSs-Nluc能有效抑制MDCK IFNβ-GFP/IFNβ-FFluc细胞中干扰素启动子的激活，证实NS1-Nluc融合蛋白保持了免疫逃避功能。

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   小鼠模型中的致病性：在C57BL/6J小鼠中，HPhTX NSs-Nluc表现出与野生型相近的致病性，MLD₅₀约为15 PFU。通过IVIS系统首次实现了H5N1感染过程的实时可视化，发现病毒在感染后2天即可在肺部检测到，4天后向其他器官扩散。

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   抗病毒药物评估平台：研究证实HPhTX NSs-Nluc可用于快速评估抗病毒药物效果。巴洛沙韦酸(BXA)对该病毒的IC₅₀为0.037 μM，与野生型相当。体内实验显示BXA处理能完全抑制病毒复制，保护小鼠免于死亡。

该研究的创新性在于首次将Nluc报告系统应用于人源H5N1病毒，建立了集病毒追踪、致病性研究和药物筛选于一体的多功能平台。相比传统方法，该技术具有三大优势：一是通过实时成像减少实验动物使用量；二是大幅缩短抗病毒药物评估周期；三是能动态监测病毒在活体中的时空分布。这些突破为H5N1的传播机制研究、疫苗开发和临床治疗策略制定提供了重要工具，尤其对应对可能出现的H5N1大流行具有重要预警价值。

研究也存在一定局限性，如IVIS成像的空间分辨率有限，难以精确定位病毒感染的具体器官或细胞类型。未来研究可结合组织切片成像等技术进一步提高定位精度，并通过统计学分析确证Nluc发光强度与病毒载量的定量关系。