TDP-43通过结合RNA G-四链体结构调控mRNA稳定性与翻译的分子机制研究

本研究揭示了TDP-43蛋白与RNA G-四链体(rG4)结构的特异性互作机制及其在神经退行性疾病中的调控作用。通过RNA bind-n-seq和SHALiPE-seq技术，研究人员发现TDP-43在K+条件下优先结合rG4结构，并证实其缺失会导致mRNA二级结构广泛解旋，尤其在3'UTR区域。关键发现是TDP-43通过稳定SLC1A5 mRNA 3'UTR的rG4结构维持其表达，为ALS等TDP-43蛋白病的治疗提供了新靶点。

　　

在神经退行性疾病研究领域，TDP-43蛋白的异常聚集一直是科学界关注的焦点。这种广泛存在于细胞中的核酸结合蛋白，在肌萎缩侧索硬化症(ALS)、额颞叶痴呆(FTD)等疾病中会发生核质转位和错误折叠，但具体分子机制尚未完全阐明。近年来研究发现，TDP-43不仅能识别经典的UG重复序列，还能与RNA中特殊的G-四链体(G-quadruplex, rG4)结构相互作用，然而这种相互作用的生物学意义及其对RNA代谢的调控机制仍存在巨大知识空白。

为破解这一难题，香港城市大学化学系Chun Kit Kwok团队与香港中文大学Huating Wang团队合作，在《Nucleic Acids Research》发表了创新性研究成果。研究团队首先采用高通量RNA bind-n-seq技术，首次在生理相关钾离子(K⁺)条件下系统鉴定了TDP-43的rG4结合偏好性。实验结果显示，与锂离子(Li⁺)条件相比，TDP-43在K⁺环境中对G-rich序列的富集程度显著更高，计算预测这些序列能形成典型的rG4结构。

研究的关键突破在于开发了改良的SHALiPE-seq技术，通过在HEK293T细胞中敲低TDP-43并比较化学探针修饰模式，首次在转录组层面揭示了TDP-43对mRNA二级结构的全局调控作用。令人惊讶的是，TDP-43缺失会导致mRNA结构广泛解旋，这种效应在3'UTR区域最为显著。通过整合eCLIP和iCLIP数据，研究人员证实这种结构变化直接源于TDP-43结合位点的丢失。

在机制研究方面，团队发现转运蛋白SLC1A5 mRNA的3'UTR存在功能性rG4结构。通过圆二色谱(CD)和荧光增强实验证实该序列能在K⁺条件下形成平行式G4结构。显微共定位和微量热泳动(MST)分析显示，TDP-43能以270 nM的亲和力特异性结合该结构。功能实验表明，TDP-43通过稳定SLC1A5的rG4结构维持其mRNA稳定性和翻译效率——当使用G4配体BRACO-19竞争性抑制TDP-43结合时，可重现敲低TDP-43导致的翻译抑制效应。

技术方法上，研究主要运用了：(1)RNA bind-n-seq分析体外结合特性；(2)SHALiPE-seq检测全转录组RNA结构变化；(3)细胞成像与MST验证蛋白-RNA互作；(4)报告基因系统评估rG4功能；(5)甲基化RNA免疫沉淀(MeRIP)分析m⁶A修饰变化。所有实验均在HEK293T和SH-SY5Y细胞系中完成。

研究结果部分的重要发现包括：

TDP-43识别生理相关钾离子条件下的G-四链体序列

通过六种浓度梯度的RBNS实验，发现TDP-43在K⁺条件下对GGGN_1-7GGGN_1-7GGGN_1-7GGG基序的富集程度比Li⁺条件高3倍，RNAfold预测显示这些序列能形成稳定的G4结构。

SHALiPE-seq揭示TDP-43依赖的转录组RNA结构变化

在TDP-43敲低细胞中，3'UTR的平均NAI反应性显著增加(△reactivity=0.37)，dStruct分析鉴定出15，473个差异反应区域(DRR)，其中88.5%表现为结构松散化。

TDP-43结合位点的局部结构调控

整合iCLIP数据显示，TDP-43结合位点在敲除细胞中呈现更显著的结构解旋(P<0.001)，且这些位点中rG4序列的比例比非DRR区域高2.1倍。

SLC1A5 rG4的功能验证

CD光谱在264nm处的正峰和245nm处的负峰证实了K⁺依赖性G4形成。BRACO-19竞争实验测得IC₅₀为5.84μM，报告基因显示移除rG4可使荧光素酶活性降低40%。

这项研究的重要意义在于：首次建立了TDP-43-rG4互作与mRNA代谢调控的分子联系，揭示了RNA二级结构在TDP-43功能中的核心地位。特别值得注意的是，SLC1A5作为神经系统重要的氨基酸转运体，其表达失调与ALS病理密切相关。研究发现TDP-43通过"结构守护"机制保护rG4免受m⁶A修饰和降解，这为理解神经退行性疾病中TDP-43功能丧失的后果提供了新视角。技术层面开发的SHALiPE-seq分析方法，为研究RNA结合蛋白的结构调控功能建立了范式。这些发现不仅拓展了对TDP-43生物学功能的认识，更为开发以rG4为靶点的神经保护策略奠定了理论基础。