枯草芽孢杆菌孢子外壳中新型脱氧己糖同聚物奎诺糖的结构表征与生物合成及其在孢子粘附中的作用

为解决食品加工中枯草芽孢杆菌孢子污染导致的食品安全问题，研究人员通过多组学技术首次鉴定了孢子外壳中的新型脱氧己糖同聚物奎诺糖（quinovosan），解析了其由9个奎诺糖（Qui）残基构成的重复单元结构（含α/β构型及2,3-双取代特征），揭示了yfnHGFED基因簇通过合成NDP-奎诺糖并组装该聚合物的分子机制，发现其通过两亲性特性维持外壳超分子结构而非直接影响孢子亲水性。该研究为控制食品污染提供了新靶点。

　　

在食品工业中，枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）形成的孢子是顽固的污染源，它们能抵抗高温、干燥和化学消毒剂，长期存留于加工设备表面。这些孢子最外层的外壳（crust）由蛋白质和糖类组成，其中糖类成分的结构和功能长期未被阐明。尤为棘手的是，外壳糖类通过影响孢子表面特性（如亲水性和电荷分布）介导其粘附行为，但具体作用机制不明。这导致食品加工中约30%的损失与孢子污染相关，亟需从分子层面解析外壳糖类的组成与功能。

法国里尔大学的研究团队在《Carbohydrate Polymers》发表的研究中，首次从枯草芽孢杆菌孢子外壳中分离出一种全新的脱氧己糖同聚物——奎诺糖（quinovosan）。通过Folch提取结合反相色谱纯化获得糖类富集组分，综合运用气相色谱（GC）、质谱（MS）、核磁共振（NMR）和扩散排序谱（DOSY-NMR）等技术，研究者不仅解析了该聚合物的精细结构，还揭示了其生物合成通路及生理功能。

主要技术方法

研究采用孢子压碎法分离外壳组分，通过Folch相分离和C18柱层析纯化奎诺糖富集片段。结构解析采用GC-MS分析甲基化衍生物（PMAA法）、MALDI-FT-ICR质谱测定分子量分布、900 MHz NMR（包括COSY、TOCSY、HSQC、HMBC等）确定糖苷键连接方式。功能研究通过构建yfn基因缺失株，结合印度墨染色显微镜观察、微生物碳氢化合物粘附（MATH）实验和zeta电位测定评估孢子表型。

3.1. 奎诺糖富集组分的纯化

通过Folch提取将外壳材料分为亲水相、两亲界面和疏水相，其中两亲界面经40%乙腈洗脱后获得奎诺糖纯度达91.4%的组分。NMR证实该组分不含蛋白质，表明奎诺糖以非共价形式存在。

3.2. 外壳中存在高分子量奎诺糖同聚物

MALDI-FT-ICR检测到m/z 461-3237的系列信号（间隔146 Da），对应聚合度1-20的奎诺糖链。DOSY-NMR估算表观分子量约65 kDa（约400个残基），稀释实验排除聚集效应。

3.3-3.5. 奎诺糖残基的构型与连接方式

手性丁醇衍生化GC-MS证实奎诺糖为D-构型。PMAA分析显示存在末端、3-单取代和2,3-双取代三种奎诺糖残基。NMR解析出9残基重复单元：2个末端α-Quip、5个3-O-取代α-Quip（δ_C3 80-84 ppm）、2个2,3-双取代β-Quip（δ_C2 73.9 ppm, δ_C3 83.6 ppm），通过HMBC确定的糖苷键连接模式为：[-α-D-Quip-(1→3)-β-D-Quip-(1→3)-[α-D-Quip-(1→2)]-β-D-Quip-(1→3)-α-D-Quip-(1→3)]_n。

3.6. yfnHGFED基因是奎诺糖生物合成所必需的

缺失yfnH、yfnG、yfnF、yfnE或yfnD均导致孢子外壳奎诺糖消失，但胞内奎诺糖仅在ΔyfnH/ΔyfnG中完全缺失，提示YfnH（推测为葡萄糖-1-磷酸核苷转移酶）和YfnG（NDP-葡萄糖脱水还原酶）参与奎诺糖前体合成，而YfnF/E/D（糖基转移酶）负责聚合物组装。

3.7-3.8. 奎诺糖的功能解析

印度墨染色显示Δyfn突变体孢子外壳扩张（面积增加2-3倍）且结构疏松，但MATH实验表明表面亲水性未改变。zeta电位测定仅ΔyfnE孢子电荷显著降低（-55 mV→-45 mV）。聚丙烯粘附实验显示所有突变体粘附率降至0-0.5%（野生型3.5%），证实奎诺糖通过维持外壳致密性间接影响粘附。

这项研究首次报道了细菌中罕见的奎诺糖同聚物，其两亲性特性可能介导外壳中亲水/疏水组分的相互作用。提出的生物合成途径中，YfnH/YfnG将葡萄糖-1-磷酸转化为NDP-奎诺糖的创新机制有别于经典的鼠李糖合成通路。尽管奎诺糖对孢子表面电荷影响有限，但其对外壳结构的调控作用为控制食品加工中的孢子污染提供了新思路——针对yfn基因簇的干预可能破坏孢子外壳完整性，从而增强清洁效果。未来研究可聚焦奎诺糖与外壳蛋白（如CgeA糖蛋白）的相互作用机制，以及其它外壳糖类的协同作用。