基于U1 snRNA增强子和主要剪接供体突变提高慢病毒载体产量与质量的新型TetraVecta?系统

本研究针对第三代慢病毒载体(LV)生产过程中因主要剪接供体(MSD)活性导致的异常剪接vRNA问题，通过开发2KO-LV平台（结合MSD失活序列优化）和新型U1 snRNA增强子（靶向ψ包装序列），显著提升载体产量（最高达10倍）并消除异常剪接产物。该TetraVecta?系统与TRiP系统?联用可完全抑制转基因蛋白表达，为CAR-T等基因治疗产品提供了更安全、高效的生产方案。

　　

在基因治疗领域，慢病毒载体(LV)因其能高效递送大片段基因至分裂/非分裂细胞的特性，已成为CAR-T疗法和遗传病治疗的重要工具。然而，基于HIV-1的第三代LV仍保留着复杂的顺式作用元件，其中位于包装信号(ψ)内的主要剪接供体(MSD)会引发大量异常剪接事件——从MSD到转基因序列内的隐蔽剪接受体(cr-sa)的剪接，导致产生缺乏内部启动子但含转基因编码序列的异常vRNA。这不仅造成组织特异性启动子在LV生产中"泄漏性"表达，还影响TRiP系统?（通过TRAP蛋白阻断翻译）的抑制效果，更严重的是这些剪接vRNA能被包装入载体颗粒并转化为靶细胞内的游离型cDNA，带来潜在安全隐患。

为攻克这些难题，牛津生物医学公司的J. Wright团队开发了创新性解决方案。研究人员首先通过RNA测序和RT-qPCR证实，在EF1α启动子驱动的LV中，超过95%的转录本会发生MSD异常剪接。通过构建系列MSD突变体（如2KO、2KOm5），他们发现完全灭活MSD及邻近的隐蔽剪接位点(crSD1-3)可消除异常剪接，但会导致载体滴度下降6-100倍。为补偿这一损失，团队创造性地设计了一类靶向ψ区域的修饰U1 snRNA（如256U1[15 nt]），其通过非polyA抑制机制将2KO-LV滴度提升至超过第三代LV水平。结构分析显示，优化的2KOm5变体通过维持SL2环与内源U1 snRNA的氢键相互作用，在保证剪接失活的同时最大程度保留载体产量。

关键技术包括：1）采用悬浮培养HEK293T细胞进行LV生产；2）通过RNAseq和SYBR Green qPCR定量分析剪接vRNA；3）开发特异性检测MSD-EF1α剪接受体连接点的qPCR方法；4）GMP级阴离子交换色谱纯化工艺；5）质谱分析载体蛋白组成。研究团队还利用健康供体外周血单核细胞(PBMC)评估了CAR-T细胞的功能活性。

主要研究发现包括：

1. 1.

   MSD突变与U1 snRNA增强机制：2KOm5-LV在256U1[15 nt]共表达时滴度提升最显著（7-25倍），且电泳与测序证实完全消除异常剪接产物。突变体设计的精妙之处在于：2KOm5的SL2替换序列虽非功能性剪接位点，但能维持与内源U1 snRNA的20个氢键相互作用，这对维持转录延伸至关重要。

2. 2.

   载体质量提升：RNAseq显示2KO-LV中未剪接vRNA占比达83%（第三代LV仅5%），纯化后载体中完全检测不到剪接vRNA。靶细胞实验证实，第三代LV产生的MSD-EF1α剪接vRNA会形成游离型cDNA（占早期总cDNA的50%），而2KO-LV仅产生稳定整合的cDNA。

3. 3.

   TRiP系统?优化：创新的kzktbsV0 5'UTR设计使tbs序列与Kozak序列重叠，在2KO-LV中实现99.9%的转基因抑制效率。相比之下，含ψ序列的异常剪接mRNA对TRAP抑制几乎无响应，这解释了为何第三代LV中TRiP效果有限。

4. 4.

   规模化生产验证：在GMP-like工艺中，256U1[15 nt]使LV-CAR5T4的颗粒/感染比提升3倍，质谱证实载体蛋白组成正常。转导实验显示，7倍浓缩的增强型LV制剂仍保持等效的CAR表达和肿瘤细胞杀伤力。

这项研究的意义在于：TetraVecta?系统通过分子水平的精准设计，解决了LV生产中长期存在的质量与产量矛盾。2KO-LV平台不仅消除了异常剪接产物的安全风险，其与U1 snRNA增强子、TRiP系统?的协同作用更为CAR-T等先进疗法提供了标准化生产平台。特别值得注意的是，该技术对组织特异性启动子载体（如肝靶向ET启动子）的优化效果显著，避免了通过启动子改造来抑制"泄漏表达"的传统做法。这些突破为LV在高剂量体内应用的安全性树立了新标准，将加速基因治疗向更广泛适应症拓展。