低温辅助纳米孔技术直接鉴定O-糖肽及其在癌症诊断中的应用

为解决O-糖肽因糖链复杂性和异质性导致的检测难题，研究人员开发了一种低温纳米孔技术，可同时区分4种截短O-糖肽变体（Tn/STn/TF/STF），准确率达92.9%。该技术无需标记即可实现直接鉴定和相对定量，为癌症早期诊断提供了新工具。

　　

糖基化修饰是蛋白质翻译后修饰中最复杂的类型之一，尤其在癌症中，异常的O-糖基化模式（如MUC1蛋白的截短糖链）已成为重要生物标志物。然而，传统检测方法如质谱（LC-MS/MS）和免疫分析面临糖链电离效率不均、抗体交叉反应等技术瓶颈，且无法实现多组分同步精准检测。纳米孔技术虽具备单分子检测潜力，但糖肽的庞大空间位阻和相似电流信号使其区分困难。

针对这一挑战，研究团队创新性地提出低温（10°C）和低pH（3.0）协同调控策略，通过改造K238G Aerolysin（AeL）纳米孔，增强糖肽捕获能力并延长相互作用时间。实验表明，低温条件使糖肽在纳米孔内的停留时间延长1.5-1.8倍，电流阻塞信号分离度显著提升。研究选取MUC1重复串联区（VNTR）的四种截短O-糖肽变体——Tn（GalNAcα-）、STn（Neu5Acα2-6GalNAcα-）、TF（Galβ1-3GalNAcα）和STF（Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAcα-）作为模型，在+160 mV电压下实现92.9%的机器学习分类准确率（AUC=0.995）。

关键技术包括：1）K238G AeL纳米孔构建与表征；2）低温（10°C）及酸性（pH 3）条件下单通道电流记录；3）基于阻塞电流（I/I₀）、持续时间、标准差和偏度的四维特征提取；4）多层感知机（MLP）模型训练与验证。

研究结果显示：

1. 1.

   单O-糖肽检测条件优化：酸性环境使K238G AeL孔道内正电荷残基（R282/R220/K242）暴露，增强电渗流（EOF）。与野生型（WT）肽相比，Tn肽的纳米孔相互作用焓变更高（47.74 vs 25.89 kJ/mol），熵变更低（-20.3 vs -95.2 J/mol·K），说明GalNAc修饰增强结合稳定性。

2. 2.

   多组分区分能力：STn与STF因唾液酸羧基与孔道精氨酸相互作用呈现双峰分布，通过聚类分析分离后，五类肽变体（含WT）的I/I₀值差异显著（WT:0.45, Tn:0.36, TF:0.33, STn:0.18, STF:0.10）。

3. 3.

   实际样本验证：在含0.2%细胞裂解液或1%牛血清白蛋白（BSA）的复杂基质中，模型仍能准确识别糖肽组分，如STn在混合样本中的回收率达93.3%-99.4%。

结论指出，该技术突破了传统方法对糖肽检测的通量和灵敏度限制，未来结合纳米孔阵列芯片可推动糖基化标志物的高通量筛查。研究局限性在于实际样本中糖肽浓度（纳摩尔级）需抗体预富集，且更长糖链需酶解后分段检测。论文发表于《Research》，为癌症糖组学分析提供了革命性工具。