铜绿假单胞菌PilD突变体的鉴定揭示细菌群体中合作与欺骗行为的迭代社会进化

本研究通过体外进化实验揭示了铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）在群体感应（QS）激活环境下从LasR-MexT合作者到PilD欺骗者的迭代社会进化轨迹。PilD突变体通过下调Rhl和PQS群体感应系统表现出社交欺骗行为，导致胞外蛋白酶分泌缺陷和宿主细胞毒性降低，为理解细菌致病性动态演变提供了新视角。

　　

引言

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）是一种机会性病原体，其致病性与群体感应（Quorum Sensing, QS）系统密切相关。QS通过细胞密度依赖性机制调控数百个基因表达，包括Las、Rhl和PQS三个层级系统。临床分离株中常见的LasR突变体因丧失QS信号响应能力被视为“社交欺骗者”，而MexT突变可使其恢复为合作者。然而，这种合作者群体的后续进化轨迹尚不明确。

材料与方法

研究采用体外进化实验，以LasR-MexT缺陷型PAO1菌株为起点，在需要QS激活的酪蛋白培养基中连续传代。通过脱脂牛奶平板筛选蛋白酶阴性突变体，结合全基因组测序（WGS）和表型分析，鉴定出携带pilD突变的亚群。利用GFP报告系统（PrhlA-GFP/PpqsA-GFP）评估QS活性，并通过细胞毒性（LDH释放）和运动性（twitching）实验验证功能。

结果

PilD突变体的鉴定与特征

进化实验发现，PsdR-LasR-MexT合作者群体在传代过程中分化为蛋白酶阴性的PilD突变体。WGS确认pilD突变（Leu235Pro）导致T2SS/T4P功能缺陷，表现为蛋白酶分泌缺失和运动能力丧失。互补实验证实pilD回补可恢复表型。

社会欺骗行为与QS调控

竞争实验显示，PilD突变体在酪蛋白培养基中快速取代亲本MexT合作者（初始比例10%升至90%），最终导致群体崩溃。GFP报告系统表明，PilD突变显著抑制Rhl和PQS QS活性（PpqsA-GFP下调5.8倍），并减少绿脓菌素（pyocyanin）和生物膜产量。

致病性动态变化

PilD突变使中国仓鼠卵巢（CHO）细胞毒性降低，与LasR-null突变体水平相当。这一现象与QS调控的毒力因子（如弹性蛋白酶elastase）分泌减少一致，揭示了社会行为迭代与致病性变化的关联。

讨论

研究首次描绘了铜绿假单胞菌从野生型→LasR欺骗者→MexT合作者→PilD欺骗者的完整进化路径，提出“迭代社会进化”模型。PilD作为非典型QS信号盲突变体，通过干扰T2SS/T4P间接调控PQS系统，拓展了细菌社交作弊的分子机制认知。临床分离株中PilD突变的高频出现暗示其在慢性感染（如囊性纤维化CF）中的适应性优势。

意义与展望

该研究为理解细菌群体动态和致病性演变提供了框架，提示针对QS和社会行为的干预策略或可延缓抗生素耐药性发展。未来需探究PilD突变在宿主微环境中的选择压力及其与临床预后的关联。