双基因缺失减毒非洲猪瘟病毒株HuBΔCD2vΔA137R的构建及其对同源攻毒提供完全保护作用的研究

（编辑推荐）本研究通过CRISPR/Cas9技术构建了同时缺失CD2v和A137R基因的非洲猪瘟病毒（ASFV）减毒株HuBΔCD2vΔA137R。实验证实该毒株在猪体内毒力显著减弱（接种105 TCID50后无发热＞40.5°C），可诱导抗p30抗体产生，并对102 HAD50强毒株攻毒提供完全保护。转录组分析显示该毒株通过激活Toll样受体/RIG-I样受体通路触发先天与适应性免疫，为ASFV减毒活疫苗研发提供了新策略。

　　

ABSTRACT

非洲猪瘟（ASF）对全球养猪业造成毁灭性打击，开发安全有效的疫苗迫在眉睫。研究团队从中国分离的基因II型强毒株HuB/HH/2019出发，通过同源重组和CRISPR/Cas9技术同步敲除免疫调节基因CD2v（EP402R）和免疫逃逸基因A137R，构建了携带荧光标记的双基因缺失减毒株HuBΔCD2vΔA137R。

Production of the double deletion mutant HuB△CD2v△A137R

基因编辑策略保留了CD2v基因33bp片段，插入p72启动子驱动的eGFP/mCherry双荧光报告系统。全基因组测序证实缺失纯度达99.99%（仅＜5条序列比对到野生型）。血吸附试验显示缺失株丧失红细胞吸附能力，而体外生长曲线证明其在猪肺泡巨噬细胞（PAMs）中的复制能力与亲本毒株无显著差异（P＞0.05）。转录组数据显示缺失株感染后干扰素刺激基因（ISGs）表达量较野生型提升3-5倍。

The virulence of HuBΔCD2vΔA137R was highly attenuated in pigs

6.5kg仔猪接种10⁵ TCID₅₀后，27天观察期内全部存活，仅2/4出现短暂体温升高（40.1-40.3°C）。病毒血症在7 dpi达峰值（10^5.5 copies/mL），24 dpi完全清除。值得注意的是，肛门拭子检测到间歇性排毒现象，提示需关注疫苗株环境扩散风险。组织病理学显示接种猪的肺组织仅存在轻度肺泡间隔增宽，与强毒株导致的出血性肺炎形成鲜明对比。

HuBΔCD2vΔA137R could protect against ASFV challenge

攻毒实验显示，免疫组3头猪在10² HAD₅₀强毒攻击后22天内全部存活，无发热或临床症状。而对照组2头猪分别于7/11 dpi死亡，死前病毒载量高达10⁹ copies/mL。免疫组中1头猪（V-4#）的脾脏和淋巴结检出野生型病毒（10⁵ copies/mL），提示疫苗保护并非绝对 sterilizing immunity。

HuBΔCD2vΔA137R activated both innate and adaptive immune responses

PBMCs转录组揭示：接种3 dpi时PI3K-Akt通路和白细胞跨内皮迁移通路激活；7 dpi时Toll样受体/RIG-I样受体信号通路显著上调（NES=2.3）。ELISA检测显示抗p30抗体在14 dpi达到平台期（OD₄₅₀=1.8±0.3），且攻毒后未出现回忆反应，表明免疫记忆已充分建立。

DISCUSSION

与单基因缺失株相比，双缺失策略展现出独特优势：①A137R缺失解除其对TBK1的自噬降解作用，恢复I型干扰素产生；②CD2v缺失逆转其对cGAS-STING通路的抑制，二者协同增强ISGs表达。研究还发现抗pA137R抗体可能通过FcγRII/III介导抗体依赖性增强（ADE）效应，这为疫苗安全性评估提供了新视角。

MATERIALS AND METHODS

实验在中国兽医药品监察所生物安全三级实验室（CNAS BL0086）完成。病毒滴度测定采用Reed-Muench法，HAD₅₀与TCID₅₀转换系数为1:150。RNA-seq使用NovaSeq 6000 S4平台，数据经DESeq2分析（|log2FC|＞1，P＜0.05）。临床评分系统涵盖6项指标，体温＞40.5°C计3分，皮肤发绀计2分，总分≥5分判定为重症。