全基因组测序与系统发育分类加速加拿大呼吸道合胞病毒基因组监测的实施：一项试点研究

这篇研究推荐采用多重叠瓦式PCR（multiplex tiling PCR）技术，开发了针对呼吸道合胞病毒A型（RSVA）和B型（RSVB）的高通量全基因组测序（WGS）方案，成功从加拿大2022-2023年呼吸道病毒季的临床样本中获取52例RSVA和37例RSVB近完整基因组。通过全基因组与G基因（glycoprotein）系统发育分析对比，证实前者具有更高的分辨力，并鉴定出融合蛋白（F蛋白）关键位点突变（如S377N、K272M等），这些突变可能影响现有疫苗（如RSVPreF3）和单抗（如nirsevimab）的效力，为疫苗研发和公共卫生策略提供了重要数据支持。

　　

摘要

研究团队开发了针对呼吸道合胞病毒（RSV）A型和B型的多重叠瓦式PCR（multiplex tiling PCR）测序方案，通过优化引物设计覆盖99%基因组区域，实现了从临床样本中高效获取高质量基因组数据。试点研究分析了加拿大四省2016-2023年的89例样本，生成52例RSVA和37例RSVB近完整基因组，为后续系统发育和突变分析奠定基础。

材料与方法

参考毒株与临床样本

研究采用ATCC参考毒株（如VR-955）及加拿大四省（BC、SK、MB、ON）2016-2023年的临床鼻咽拭子样本，通过qRT-PCR（quantitative real-time PCR）确认RSV分型。

引物设计与优化

基于PrimalScheme工具，针对RSVA（800-900 nt重叠扩增子）和RSVB（500 nt扩增子）设计引物，并通过MAFFT比对和手动调整确保覆盖基因组末端。例如，RSVA引物覆盖99%基因组，包含24个扩增子；RSVB则设计38个扩增子。

测序与生信分析

使用Nanopore MinION平台进行测序，通过Guppy和viralassembly流程完成碱基识别、变异检测和一致性序列生成。全基因组定义为包含NS1首密码子至L蛋白末密码子的序列（约15.2 kb）。

结果

系统发育分析

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  RSVA：176例基因组（含124例参考）按G_Clade分为9支，加拿大样本主要属于A.D.5.2（25/52）。全基因组树比G基因树更精准，例如区分了SK省2023年的4例高度相似毒株（RV00279/88和RV00290/92）。

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  RSVB：123例基因组中，加拿大样本以B.D.E.1为主（30/37），2016年SK样本则属于B.D.4.1。全基因组分析揭示了G基因无法区分的簇内差异（如ON省2022年4例毒株）。

关键突变鉴定

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  RSVA：F蛋白抗原位点II（palivizumab靶点）检出K272M（1例）和S276N（5例）；抗原位点III（RSVPreF3疫苗靶点）发现S377N（3例）。

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  RSVB：抗原位点?（nirsevimab靶点）高频突变包括S211N（32例）、M206I（3例）和R209Q（3例），可能影响单抗疗效。

讨论

研究证实多重PCR结合纳米孔测序可高效支持RSV基因组监测。全基因组数据比传统G基因分析更具分辨力，尤其适用于追踪传播链和评估疫苗逃逸突变。例如，F蛋白S377N突变可能位于RSVPreF3疫苗的免疫优势表位，而S211N等突变需进一步验证对nirsevimab的影响。

意义

该方案为加拿大RSV疫苗和单抗的免疫策略提供了实时基因组数据，未来可通过扩大样本量和功能实验验证突变对临床干预措施的影响。