基于稳定生产细胞系的WAS基因治疗慢病毒载体生产工艺优化：平板系统与灌注式贴壁生物反应器的比较研究

本研究系统比较了GPRG与GPRTG两种稳定包装细胞系（PCL）在慢病毒载体（LV）生产中的性能差异，创新性地采用串联体（concatemer）转染技术建立高滴度Wiskott-Aldrich综合征（WAS）基因治疗用LV稳定生产体系。通过平行评估平板培养系统（CellSTACK）、iCELLis? Nano和Scale-X? Hydro三种贴壁培养系统的生产工艺，证实Scale-X? Carbo 10 m2生物反应器可实现1.13E+12 TU/批次的临床级LV生产，其产物在CD34+造血干细胞中展现出优异转导效率（VCN达4.93@MOI=1）。

　　

优化转染条件建立稳定生产细胞系

研究团队通过系统比较ViaFect?、Lipofectamine? 3,000和CalPhos?三种转染试剂的效率，发现Lipofectamine? 3,000配合p3000增强剂在GPRG包装细胞系（PCL）中转染GFP串联体（含25个GFP基因拷贝和1个Zeocin抗性基因）时效果最优，转染72小时后GFP阳性细胞率>95%。经过21天Zeocin（50 μg/mL）筛选后，转染7.5-10 μg串联体的细胞群体显示出最高荧光强度（MFI），相应产生的LV滴度达4.45E+06 TU/mL，较5 μg组提升4倍。这种串联体转染策略通过促进多拷贝载体基因组整合，为建立高滴度生产细胞系奠定了基础。

GPRTG包装细胞系展现卓越生产性能

在比较GPRG与GPRTG两种PCL时，研究发现GPRTG-WAS稳定池产生的LV具有显著优势：平均滴度达2.17E+06 TU/mL，是GPRG-WAS的6.6倍；物理滴度（p24检测）达3.9E+10 vp/mL，提高1.8倍；RNA完整度（3′/5′比值）相当但功能性病毒颗粒比例提升3.6倍。这种差异源于GPRTG特有的Tat蛋白表达，其通过增强转录延伸和Rev蛋白功能，显著提升病毒产量。更重要的是，GPRTG来源的LV在CD34⁺造血干细胞中呈现剂量依赖性转导，MOI=10时载体拷贝数（VCN）达4，而GPRG来源LV在相同条件下无法突破VCN=1的限制。

单克隆细胞系的长期稳定性验证

通过单细胞分选从多克隆池中获得的51个单克隆中，克隆66展现最高滴度（1.33E+08 TU/mL）。长达60-67天的稳定性研究表明，4个优选克隆中有3个保持产量波动≤25%，其中克隆173在8次生产运行中维持平均2.1E+07 TU/mL的稳定输出。靶向位点扩增（TLA）测序证实该克隆在染色体X上存在单一整合位点，且生产第6批（P6）与第1批（P1）的NGS分析显示载体序列一致性>95%，仅发现2个频率>5%的非编码区沉默突变，证明该生产体系具有优异的遗传稳定性。

平板培养系统的工艺优化

针对传统CellSTACK系统存在的细胞脱落问题，研究团队优化发现：未包被表面、2E+04 cells/cm²接种密度配合96小时生长阶段的方案最佳，总产量较8.5E+04 cells/cm²直接诱导方案提高20%。取消诱导时的洗涤步骤可减少30%的操作变异，但10层CellSTACK（CS10）的单位面积产量仍比单层系统低20-30%，这归因于多层系统的营养扩散限制。值得注意的是，GPRTG细胞因高产LV导致的逆向转染现象，使其在平板系统中仅能维持2-4次收获，而GPRG细胞可达10次。

生物反应器系统的工艺对决

在小型生物反应器比较中，Scale-X? Hydro 2.4 m²以1.36E+11 TU/批次的表现优于iCELLis? Nano 4 m²（9.28E+10 TU）。关键发现包括：1）灌注模式中不进行诱导时培养基置换的方案总产量提高28%；2）pH自然降至6.7时滴度最高，人工维持pH7.2反而降低产量；3）0.19 mL/cm²/天的灌注速率最佳，过高会导致LV稀释。Scale-X?系统凭借PET无纺布与聚乙烯间隔网组成的特殊固定床结构，实现更均匀的细胞分布和更高kLa值。

规模化生产的临床转化潜力

将工艺放大至Scale-X? Carbo 10 m²后，三个版本（V1/V1.4/V2）的生物反应器均展现良好重现性，其中WAS构建体3的单克隆细胞系实现1.13E+12 TU/批次的突破性产量。经计算，单批次产物纯化后（30%回收率）可满足140例50kg WAS患者治疗需求（5E+06 CD34⁺ cells/kg，MOI=10）。 transduction研究显示，该LV在MOI=1时即可实现4.93 VCN的优异转导效率，较平板系统产品（4.1 VCN）更具临床优势，能有效降低插入突变风险。该工艺已成功完成GMP生产转化，为WAS基因治疗提供了可靠的产业化解决方案。