南极细菌新型冷适应酯酶Est2的发现与表征：定义酯酶家族XXII及其环境修复应用潜力

本文报道了从南极假单胞菌Pseudomonas sp. A6-5中鉴定出的新型冷适应酯酶Est2，通过系统发育分析确立其为酯酶家族XXII的创始成员。该酶在0-15°C保持20-85%活性，催化三联体（Ser141-Asp275-His303）位于经典GXSXG motif中，对中链pNP酯（C6-C8）和甘油三酯具有特异性水解能力。研究揭示了其结构稳定性主要依赖疏水作用而非离子力，为低温生物催化提供了新工具。

　　

1 引言

南极微生物产生的极端酶（extremozymes）是独特生物催化剂的潜在来源。本研究从南极细菌Pseudomonas sp. A6-5中鉴定出新型酯酶基因est2，其编码的338个氨基酸蛋白不含信号肽，提示为胞内酶。系统发育分析显示Est2与已知21个酯酶家族形成独立分支，序列相似度仅7.24%，被确立为家族XXII创始成员。该发现扩展了细菌酯酶分类体系，此前最新分类仅包含家族XXI（由南极酯酶Est33定义）和家族XX（以耐热酯酶EstC为代表）。

冷适应酶的结构特征在Est2中得到充分体现：与耐热同源酶EstC相比，Est2具有更长的催化环（18 vs 13个氨基酸）、更大的催化腔（308.5 vs 124.9 ?³）以及更多暴露的疏水残基。这些适应性与典型冷适应策略一致——通过降低脯氨酸含量、增加天冬酰胺/赖氨酸/甲硫氨酸等不稳定残基，以及扩展蛋白表面环状结构来增强分子柔性。

2 材料与方法

est2基因克隆至pMAL-c2x载体并表达为MBP融合蛋白，经麦芽糖树脂亲和层析纯化后，用Factor Xa蛋白酶切除标签获得37 kDa活性酶。酶活测定以对硝基苯酚（pNP）酯为底物，通过405 nm吸光度检测水解产物。温度适应性测试显示Est2在0°C仍保持20%活性，最适温度为30°C，高于40°C迅速失活。

3 结果

3.1 序列与结构特征

AlphaFold2预测显示Est2具有典型α/β水解酶折叠（9β片层+10α螺旋），催化三联体Ser¹⁴¹-Asp²⁷⁵-His³⁰³间距均为1.9 ?。独特的是，其活性位点附近聚集5个甘氨酸残基，显著增强低温下的局部柔性。

3.2 底物特异性

Est2对pNP辛酸酯（C8）活性最高，对三辛酸甘油酯的水解效率是三丁酸甘油酯的1.8倍，而对月桂酸甘油酯（C12）无活性，明确其作为中链酯酶的定位。

3.3 环境敏感性

过渡金属（1 mM Cu²⁺/Zn²⁺/Co²⁺）抑制80%以上活性，而碱金属影响微弱。极性溶剂中仅DMSO耐受性较好（20%浓度保留45%活性），表明其稳定性主要依赖疏水相互作用。

3.4 与EstC的对比

Est2的非极性可及表面积（9,404.5 ?²）比EstC高23%，催化腔体积大147%，且额外含有2个底物通道。这些结构差异解释了其冷适应特性：扩大疏水表面补偿低温下减弱的疏水作用，扩展的活性腔维持低温底物可及性。

4 讨论

Est2的发现为酯酶进化研究提供了新视角。其保留的GXSXG motif和催化三联体证实了α/β水解酶超家族的保守性，而独特的序列特征（如催化环插入序列）则定义了家族XXII。该酶在0°C的持续活性（20%）优于多数报道的冷适应酯酶，如南极酯酶Est19（最适25°C）和MHlip（最适30°C），但热稳定性较差——40°C孵育15分钟即失活50%，符合"柔性-稳定性"权衡规律。

底物谱分析揭示Est2填补了现有冷适应酯酶的功能空白：不同于严格短链特异的EstN7（C2-C4）和广谱的Pseudomonas fragi脂肪酶，其对C6-C8酯的特异性可能反映南极环境中中链脂质的代谢需求。值得注意的是，Est2对三酰甘油的水解能力（C4-C8）支持其在低温油脂加工中的应用潜力，而过渡金属敏感性提示需避免工业废水中的重金属污染。

结构-功能关系研究表明，Est2通过多重策略实现冷适应：1）活性位点甘氨酸簇增强局部柔性；2）减少脯氨酸（4.7% vs EstC的6.1%）降低刚性；3）扩大疏水表面维持低温下的蛋白折叠。这些发现为理性设计工业用冷适应酶提供了新思路。

综上，Est2作为家族XXII的首个代表，不仅丰富了酯酶多样性认知，其独特的结构特征和催化性能更为低温生物催化、极地环境修复等应用提供了候选分子。未来研究可聚焦于其晶体结构解析和蛋白质工程改造，以进一步优化操作稳定性和催化效率。