丝氨酸/苏氨酸激酶33作为蟾毒灵治疗三阴性乳腺癌的新靶点：机制探索与临床转化前景

本研究首次揭示传统中药蟾毒灵（Bufalin）通过靶向降解丝氨酸/苏氨酸激酶33（STK33）抑制三阴性乳腺癌（TNBC）的新机制。运用SPR-LC-MS/MS技术鉴定STK33为Bufalin的直接作用靶点，证实其通过破坏STK33-HSP90复合物促进泛素化降解，进而抑制CCAR1/β-catenin信号通路。在患者来源类器官（PDO）模型中验证了Bufalin的治疗潜力，为TNBC靶向治疗提供新策略。

STK33作为蟾毒灵抗TNBC的新靶点

Abstract

研究团队通过表面等离子共振-液相色谱-质谱联用技术（SPR-LC-MS/MS）筛选发现，传统中药华蟾素主要活性成分蟾毒灵（Bufalin）能特异性结合丝氨酸/苏氨酸激酶33（STK33）。分子对接和生物素下拉实验证实STK33的蛋氨酸245位点是关键结合位点。临床数据分析显示STK33在TNBC组织中高表达且与不良预后相关，机制研究表明其通过磷酸化稳定CCAR1蛋白促进肿瘤进展。

2.1 STK33与蟾毒灵的相互作用

通过生物素标记的蟾毒灵进行下拉实验，发现STK33呈现剂量依赖性结合。分子动力学模拟揭示STK33的M245、C195、K240等残基与蟾毒形成氢键和疏水相互作用，其中M245A突变完全阻断结合能力。热位移实验显示蟾毒灵处理使STK33热稳定性提高12.3°C，共聚焦显微镜观察到两者在TNBC细胞内的共定位。

2.2 STK33的促癌功能

TCGA数据库分析显示STK33高表达患者5年生存率降低41.7%。在79例TNBC临床样本中，53.16%呈现STK33高表达。体外实验证实敲低STK33使MDA-MB-231细胞增殖抑制率达68.5%，迁移能力下降3.2倍。裸鼠移植瘤模型显示STK33敲除使肿瘤体积缩小62.3%，重量减轻57.8%。

2.3 STK33-CCAR1信号轴

质谱分析鉴定CCAR1为STK33结合蛋白，其Ser343位点含有保守的R-NB-X-S/T-HP磷酸化 motif。免疫共沉淀证实STK33使CCAR1磷酸化水平提高4.7倍，蛋白酶体抑制剂MG-132可逆转STK33敲低导致的CCAR1降解。临床样本免疫组化显示STK33与CCAR1表达呈显著正相关（r=0.83, P<0.001）。

2.4 蟾毒灵诱导STK33降解

100 nM蟾毒灵处理48小时使STK33蛋白水平下降72.4%，但不影响mRNA表达。分子模拟显示蟾毒灵使STK33-HSP90结合自由能从-30.6增至-21.7 kcal·mol^-1。免疫沉淀实验证实蟾毒灵剂量依赖性破坏两者相互作用，导致STK33泛素化水平升高5.3倍。

2.5 蟾毒灵的抗肿瘤效应

200 nM蟾毒灵处理使TNBC细胞凋亡率增加8.1倍，cleaved-PARP1表达上调6.3倍。STK33过表达使细胞对蟾毒灵敏感性提高3.5倍。在PDO模型中，蟾毒灵IC₅₀与STK33表达水平呈正相关（r=0.79），抑制率达61.2-78.5%。

3 讨论

该研究首次阐明蟾毒灵通过"分子胶"机制靶向降解STK33，其作用不依赖激酶活性抑制而是破坏分子伴侣功能。STK33-CCAR1-β-catenin信号轴的发现为TNBC治疗提供新靶点，临床前研究显示0.5 mg/kg蟾毒灵即可使移植瘤生长抑制59.3%且无肝肾毒性。