RING-Between-RING型E3连接酶ARI8通过靶向病毒运动蛋白负调控植物病毒感染

本研究首次揭示RBR型E3泛素连接酶ARI8通过介导大麦条纹花叶病毒（BSMV）运动蛋白TGB1的泛素化降解，抑制病毒细胞间移动和系统感染。该机制在PVX和BNYVV等含TGB病毒中具有保守性，为植物抗病毒策略开发提供了新靶点。

　　

RING-Between-RING型E3连接酶ARI8负调控植物病毒感染的分子机制

Abstract

泛素-蛋白酶体系统（UPS）在植物抗病毒防御中起关键作用，但靶向病毒蛋白的E3连接酶数量有限。研究发现大麦条纹花叶病毒（BSMV）的三重基因块1（TGB1）蛋白在感染过程中发生泛素化。通过免疫共沉淀结合质谱分析，鉴定出RBR型E3连接酶ARI8能与TGB1体内外互作。过表达ARI8抑制BSMV局部和系统感染，而敲除ARI8则增强病毒扩散。ARI8介导TGB1泛素化，其Cys311残基对TGB1降解和抗病毒功能至关重要。该机制在PVX和BNYVV等含TGB病毒中具有保守性。

1 Introduction

植物与病毒长期共进化中形成了多层次的防御系统。UPS通过泛素化修饰调控病毒蛋白稳定性，但直接靶向病毒蛋白的E3连接酶报道较少。RBR型E3连接酶在生物界高度保守，但其在植物生物胁迫响应中的功能未知。BSMV属于大麦病毒属，其运动蛋白TGB1在病毒细胞间移动中起关键作用。

2 Results

2.1 TGB1蛋白在病毒感染过程中被泛素化

时间进程分析显示BSMV感染后期TGB1蛋白积累下降，而CP和γb蛋白持续增加。MG132处理显著提高TGB1稳定性，体外降解实验证实TGB1通过26S蛋白酶体途径降解。免疫印迹检测到TGB1的多聚泛素化修饰，且泛素化水平随感染进程增强。

2.2 ARI8与TGB1体内外互作

质谱分析发现ARI8是TGB1互作蛋白中排名最高的E3连接酶。亚细胞定位显示BSMV感染诱导ARI8重定位至胞间连丝（PD），与GFP-TGB1共定位。Luciferase互补成像（LCI）和双分子荧光互补（BiFC）实验证实两者互作，免疫共沉淀和GST pull-down证明互作特异性。

2.3 ARI8负调控BSMV感染

过表达ARI8显著抑制BSMV系统感染，而病毒诱导的基因沉默（VIGS）敲低ARI8增强病毒积累。利用sfGFP报告系统构建的ARI8过表达（OE）和敲除（KO）转基因本氏烟证实，ARI8主要通过抑制病毒细胞间移动（而非复制）发挥抗病毒功能。

2.4 ARI8介导TGB1泛素化降解

ARI8过表达促进TGB1通过26S蛋白酶体降解，MG132处理可逆转此效应。体外细菌重组系统证明ARI8具有E3连接酶活性，能直接泛素化TGB1。Cys311突变体（ARI8^C311S）丧失催化活性，无法促进TGB1降解。

2.5 ARI8调控其他含TGB病毒的感染

ARI8还能与PVX和BNYVV的TGB1蛋白互作，并通过类似机制抑制这些病毒感染。MG132处理可逆转ARI8介导的TGB1^PVX和TGB1^BNYVV降解。

3 Discussion

本研究首次揭示RBR型E3连接酶直接靶向病毒运动蛋白的机制。不同于内质网相关降解（ERAD）途径，核质定位的ARI8被招募至PD区降解TGB1，代表了一种新的抗病毒策略。ARI8在单双子叶植物中高度保守，其过表达引起的矮化表型可能与免疫激活有关。该发现为开发广谱抗病毒作物提供了分子靶点。

4 Experimental Section

详细描述了转基因植株构建、病毒接种、蛋白质互作检测、泛素化分析等实验方法。所有实验均采用3-4次生物学重复，统计学分析使用GraphPad Prism 9软件。