骨骼肌干细胞中DNA G-四链体动态图谱揭示其在肌肉再生中的功能与机制

本研究针对骨骼肌干细胞(MuSCs)在肌肉再生过程中DNA G-四链体(G4)的功能机制这一科学问题，通过CUT&RUN-seq等技术首次绘制了MuSCs谱系进展中的G4动态图谱。研究发现激活态MuSCs中G4显著诱导形成，通过促进染色质环化(Chromatin looping)和转录因子MAX协同作用调控Ccne1等关键基因表达，从而驱动肌肉再生。该成果发表于《Genome Biology》，为理解干细胞命运决定提供了新的表观遗传视角。

　　

肌肉作为人体最大器官，其再生能力依赖于骨骼肌干细胞(MuSCs)的精确调控。然而，在MuSCs从静息态到激活态的转变过程中，DNA二级结构如何参与基因表达调控仍是未解之谜。DNA G-四链体(G-quadruplex, G4)作为非经典核酸结构，虽在癌细胞中被广泛研究，但在成体干细胞中的功能机制几乎空白。这项发表于《Genome Biology》的研究首次揭示了G4在肌肉干细胞动态调控中的核心作用。

研究团队通过多组学技术发现，MuSCs激活时会出现G4的爆发式形成，这些结构通过重塑三维基因组和招募MAX等转录因子，成为调控肌肉再生的"分子开关"。这一发现不仅填补了干细胞表观遗传调控领域的知识空白，更为肌肉退行性疾病的治疗提供了新靶点。

关键技术方法包括：

1. 1.

   使用Pax7-nGFP转基因小鼠和人类腿筋肌肉样本分离不同分化阶段的MuSCs；

2. 2.

   采用BG4抗体的CUT&RUN-seq绘制G4全基因组图谱；

3. 3.

   结合Micro-C和4C-seq分析染色质三维结构；

4. 4.

   通过显微尺度热泳动(MST)验证MAX与G4的直接互作；

5. 5.

   CRISPR/dCas9系统进行位点特异性G4操控。

【G4 profiling reveals dynamic remodeling of G4s during MuSC lineage progression】

研究者首先建立了MuSCs谱系进展模型：从静息态(FISCs)→激活态(ASCs-24h/48h)→分化态(DSCs)。CUT&RUN-seq显示G4数量从FISCs的423个激增至ASCs-48h的9421个，且主要富集在启动子区(73.4%)。人类MuSCs同样呈现激活依赖性G4诱导，提示跨物种保守性。CD光谱证实Ccne1启动子区存在平行型G4结构。

【G4s regulate MuSC function and adult muscle regeneration】

G4配体PDS处理显著抑制MuSCs增殖(EdU实验)和小鼠肌肉再生(减少PAX7⁺细胞和eMyHC⁺新生肌纤维)。RNA-seq鉴定出310个G4激活的靶基因(如Ccne1)和69个G4抑制基因(如Enpp1)，分别与细胞周期和肌肉收缩负调控相关。

【G4s are enriched at loop anchors and promote loop interactions in ASCs】

Micro-C发现G4在染色质环锚点富集，双G4环(dural-G4 loops)具有最高互作频率(2362个相关基因表达最强)。PDS处理导致3128个互作减弱，证实G4对三维基因组的调控作用。

【G4-mediated E-P interaction promotes Ccne1 upregulation in ASCs】

Ccne1启动子G4通过增强子-启动子(E-P)互作激活转录。CRISPR/dCas9将核仁素靶向G4位点后，Ccne1表达下降61%，细胞增殖受阻，模拟了Ccne1敲除表型。

【MAX interacts with G4s to facilitate E-P interactions and gene transcription in ASCs】

MAX在ASCs中49%的结合位点与G4重叠，MST测定其与cMyc/Ccne1启动子G4的K_d值为1.8μM。AAV9介导的MAX敲除导致肌肉再生延迟，新生肌纤维横截面积减小27%。

【MAX promotes MuSC proliferation and adult muscle regeneration】

质谱分析揭示MAX互作蛋白多为染色质分离相关因子，而非其他bHLH家族成员。体内实验证实MAX缺失使MuSCs增殖率降低42%，再生能力受损。

该研究系统阐明了G4-MAX轴通过三维基因组重构调控肌肉干细胞命运的分子机制：静息态MuSCs中染色质开放区域预先存在G4形成潜能；激活时MAX被招募至G4位点，协同促进E-P环化和靶基因转录；分化阶段G4解离使干细胞退出增殖周期。这种动态调控模式不仅深化了对干细胞可塑性的理解，其发现的G4-MAX-Ccne1调控轴更为肌肉萎缩等疾病的干预提供了新策略——通过小分子调节G4稳定性可能成为再生医学的新方向。研究采用的跨物种验证策略(小鼠/人MuSCs)和多重基因组学技术路线，也为其他组织干细胞的表观遗传研究树立了范式。