综述：液相色谱-质谱联用技术在类固醇激素分析中的应用：样品前处理与方法开发中的问题与解决方案

这篇综述系统阐述了LC-MS/MS和LC-HRMS在类固醇激素分析中的前沿进展，重点解析了靶向与非靶向分析策略的优劣，创新性总结了酶解/衍生化等样品前处理技术，并前瞻性探讨了高温液相色谱-同位素比值质谱（HTLC-IRMS）在兴奋剂检测中的突破性应用。

　　

类固醇激素分析的挑战与机遇

类固醇激素作为四环脂肪烃衍生物，在呼吸系统发育、神经调节和免疫应答中发挥核心作用。其分析面临三大难题：生物样本中浓度跨越3个数量级（如尿液中睾酮仅1 ng/mL而雄烯二酮超1000 ng/mL）、电离效率低下（缺乏易质子化基团）、以及结构同分异构体众多（如孕烯醇酮m/z 317.238与孕酮M+2同位素峰m/z 317.247仅差9 mDa）。

靶向分析的精准武器库

三重四极杆质谱（QqQ）凭借MRM模式成为临床检测金标准，新型线性离子阱（如Thermo Stellar）通过MS³扫描（40 Hz）显著提升毛发等复杂基质中类固醇的检测特异性。典型方法学验证显示，血清中11种类固醇经固相萃取（SPE）后，LOD可达15-1000 pg/mL。而同位素稀释法则巧妙解决基质效应，如采用D₅-11-脱氧皮质醇内标时，皮质醇检测误差可控制在±5%内。

非靶向筛查的星辰大海

高分辨质谱（HRMS）通过精确质量数（R>100k）实现类固醇组学（Steroidomics）全景分析。Orbitrap结合分子网络技术已鉴定尿液152种类固醇代谢物，其中ZenoTOF 8600采用迁移时间差分（DTD）功能，将同分异构体分离效率提升3倍。值得注意的是，锁定质量校准技术使m/z偏差<1 ppm，确保17β-雌二醇（m/z 271.1696）与表睾酮（m/z 271.1692）的基线分离。

样品前处理的智慧革命

酶解工艺中，来自H. Pomatia的β-葡萄糖醛酸酶/芳基硫酸酯酶双功能酶在pH 5.2条件下实现硫酸/葡萄糖醛酸双键水解，回收率提升40%。新兴材料如锆基MOF（MIL-53(Al)）对雌激素吸附容量达120 mg/g，而分子印迹聚合物（MIPs）以睾酮为模板时，选择性系数α>8.7。衍生化策略中，吉拉德试剂P（Girard P）使皮质醇ESI响应增强80倍，而羟胺衍生物可避免传统肼类试剂的顺反异构问题。

同位素分析的破冰之旅

高温LC-IRMS（HTLC-IRMS）突破性采用200℃纯水流动相，使ZirChrom-PBD柱实现δ¹³C测定精度±0.3‰。在兴奋剂检测中，外源性睾酮的δ¹³C值（-26‰至-32‰）显著区别于内源性睾酮（-16‰至-21‰），该技术已纳入WADA标准方法。

未来发展的多维赛道

离子淌度（IMS）与机器学习联用将实现无色谱分离的类固醇快速筛查，而新型光电离源（如APA