WNK-OSR1/SPAK激酶通路相互作用图谱解析：揭示离子稳态调控新机制与疾病关联

本研究通过系统分析WNK-OSR1/SPAK激酶通路中CCT结构域与短线性基序的相互作用特征，建立了预测模型并验证了3700余种潜在相互作用。研究发现Cavin1和TSC22D1等新型互作蛋白的磷酸化修饰与亚细胞定位受WNK信号调控，揭示了该通路在细胞体积调节、高血压和神经病变中的多效性功能。研究为拓展WNK生物学认知提供了分子互作框架。

　　

在生命活动的精密调控网络中，WNK（With No Lysine [K]）激酶家族因其独特的催化位点布局而备受关注。这个古老的多效性激酶家族包含WNK1-4四个成员，它们通过磷酸化下游激酶OSR1（Oxidative Stress Responsive 1）和SPAK（STE20-related proline-alanine-rich kinase）来调控离子转运和细胞体积。虽然WNK-OSR1/SPAK通路在高血压发病机制中的作用已被阐明，但该通路如何参与神经系统疾病、代谢调控等生理过程仍存在大量未解之谜。更令人困惑的是，WNK1功能缺失突变会导致遗传性感觉神经病变（HSN2），但其分子机制至今不明。这些知识缺口严重限制了对WNK通路全貌的理解和相关疾病的治疗策略开发。

为系统揭示WNK通路的未知功能，由Clinton A. Taylor IV和Melanie H. Cobb领衔的研究团队在《Communications Biology》发表了创新性成果。研究人员聚焦于OSR1和SPAK的C末端保守结构域（CCT），这些结构域能特异性识别含有R-F-x-V/I或R-x-F-x-V/I基序的短肽序列。通过整合实验数据和生物信息学预测，团队构建了人类蛋白质组中CCT结构域相互作用图谱，不仅验证了已知互作关系，更发现了大量未被报道的调控节点，为理解WNK通路的多元功能提供了全新视角。

研究主要采用了四种关键技术方法：（1）肽阵列技术系统分析CCT结构域结合特异性；（2）荧光各向异性肽竞争实验定量测定结合亲和力；（3）免疫共沉淀验证预测的蛋白互作；（4）AlphaFold2/3蛋白质结构预测模拟互作界面。实验使用了人皮肤微血管内皮细胞（HDMEC）和HEK293T细胞模型，通过siRNA敲降和WNK抑制剂（WNK463）处理研究信号通路调控。

核心基序与侧翼残基共同决定OSR1/SPAK CCT结合特异性

通过晶体结构分析发现，OSR1 CCT结构域由β-折叠和两个α-螺旋组成，与靶肽通过β-链加成方式结合。肽阵列扫描显示，除核心R-F-x-V/I基序外，-2位甘氨酸对OSR1结合至关重要，而SPAK对此要求更为宽松。荧光各向异性实验定量证实，SPAK CCT对肽段的亲和力普遍比OSR1高2-3倍，且+7位残基能显著影响SPAK特异性结合。

CCT结构域特异性预测潜在互作蛋白

基于结合特征构建评分矩阵，从人类蛋白质组3700余个基序中筛选出872个高置信度候选。评分系统综合考虑溶剂可及性、保守性等特征，前125个预测靶标包含90%的已知互作蛋白。基因本体分析显示，这些蛋白不仅参与预期的离子稳态调控，还涉及DNA模板转录起始、p53信号等新功能领域。

关键互作蛋白的功能验证

研究发现小窝蛋白Cavin1（排名第4）的R-x-F-x-V基序与SPAK强烈互作，其Tyr156磷酸化水平受WNK信号显著调控。AlphaFold3模型提示磷酸化可能通过电荷作用影响结合。转录因子TSC22D1（排名第3）不仅与OSR1/SPAK共定位，其敲降会导致WNK1和OSR1表达异常，暗示双向调控关系。值得注意的是，NRBP1/2假激酶的CCT样结构域也能以类似机制结合TSC22D家族蛋白，拓展了互作网络边界。

CCT样结构域与替代基序拓展互作多样性

研究发现组氨酸或赖氨酸替代精氨酸的基序变体仍保持微摩尔级亲和力，提示自然界可能存在更丰富的互作模式。通过关键残基突变（如SPAK D477Q），证实酸性残基在精氨酸识别中的核心作用，该突变使NKCC2结合几乎完全丧失。

这项研究通过多学科方法绘制了WNK信号通路的全面互作图谱，其重要意义体现在三个层面：首先，建立了CCT结构域结合特性的定量预测模型，为系统生物学研究提供新工具；其次，发现Cavin1和TSC22D1等新型调控节点，将WNK通路与膜运输、转录调控等过程联系起来；最后，揭示CCT样结构域的进化保守性，提示WNK与NRBP可能通过相似机制参与细胞容积感应。这些发现不仅深化了对高血压和神经病变机制的理解，更为开发靶向WNK网络的精准干预策略奠定了理论基础。特别值得注意的是，研究中预测并验证的TBC1D4和sortilin等分子，已在本团队后续工作中被证实参与葡萄糖代谢调控，彰显了本互作图谱的预测价值。