双室共培养系统评估肝代谢存在下雄激素反应的建立与科学验证

为解决体外毒性评估中缺乏肝代谢影响的问题，研究人员开发了含3D HepaRG微组织的双室共培养系统，通过AR-CALUX和AR-INDIGO两种报告基因检测技术，证实了睾酮(T)和二氢睾酮(DHT)的雄激素反应在肝代谢作用下显著降低。该模型为评估化合物代谢调控提供了灵活可靠的平台，推动了新方法(NAMs)在风险评估中的应用。

　　

在毒理学风险评估领域，传统体外实验存在一个关键缺陷：无法模拟人体内肝脏对化合物的代谢转化作用。以雄激素受体(AR)激活评估为例，睾酮(T)在肝脏中既可能被5α-还原酶(SRD5A1)激活为活性更强的二氢睾酮(DHT)，也可能被CYP3A4和UGT2B17等酶代谢失活。这种复杂的生物转化过程在单一细胞培养体系中难以体现，导致体外实验结果与体内实际情况存在偏差。随着"3R原则"(替代、减少、优化动物实验)的推广和下一代风险评估(NGRA)的发展，建立能整合代谢功能的体外模型成为当务之急。

为突破这一技术瓶颈，由Tessa C.A. van Tongeren和Kim Boekelheide等跨国团队在《Toxicology Letters》发表的研究，对前期开发的双室共培养系统进行了科学验证。该系统创新性地采用琼脂糖水凝胶构建分隔的培养环境，在96孔板中实现3D HepaRG微组织(肝代谢源)与AR报告细胞的共培养。研究通过比较AR-CALUX(人骨肉瘤U2OS细胞系)和AR-INDIGO(非洲绿猴肾CV-1细胞系)两种报告系统，考察了培养基优化(去除氢化可的松HC)、不同成熟时间(3天vs10天)对代谢功能的影响，并新增DHT作为测试化合物。

关键技术包括：1)计算机辅助设计(CAD)不锈钢模具制备双室琼脂糖水凝胶；2)3D HepaRG微组织培养与分化；3)qRT-PCR检测代谢酶(CYP3A4、UGT2B17等)基因表达；4)免疫组化分析CYP3A4蛋白表达；5)LC-MS/MS定量T及其代谢物；6)双报告基因检测系统(AR-CALUX和AR-INDIGO)的比较验证。

研究结果部分：

4.1 氢化可的松干扰问题

发现DM培养基中的HC会干扰AR-INDIGO报告系统，通过组分排除实验确认HC是干扰源，而AR-CALUX系统不受影响。这提示不同报告系统需要特定的培养基优化。

4.2 3D HepaRG微组织特征

缩短成熟时间至3天并去除HC后，基因表达分析显示CYP3A4 mRNA水平降低，但免疫组化证实蛋白表达比例保持不变。相对表达水平为CYP2C9>CYP1A1>CYP3A4，与体内CYP3A4主导的模式存在差异，但功能性代谢活性得以保留。

4.3 CYP3A4表达一致性

无论是否含HC或不同成熟时间(1-10天)，3D HepaRG微组织中表达CYP3A4的细胞比例保持稳定，证明短期培养仍能维持代谢功能。

4.5 睾酮代谢动力学

LC-MS/MS检测显示，3天成熟微组织将30nM T转化为AD的速率为2.82 pmol/h/百万细胞，高于10天成熟组(1.30 pmol/h/百万细胞)。AD是主要代谢产物，而6βOHT和DHT低于检测限，这与使用高浓度T(200μM)的既往研究结果形成对比。

4.6 雄激素反应差异

两种报告系统均检测到肝代谢导致的AR激活降低，但灵敏度差异显著：AR-INDIGO在0.01-0.3nM DHT和0.1-0.3nM T即显示差异，而AR-CALUX需1-3nM DHT和3-10nM T才能检测。这种差异源于报告载体构建和细胞类型特性。

讨论部分强调，该双室共培养系统成功整合了人类肝代谢与靶组织反应，克服了传统体外模型的局限性。研究证实系统可适配不同报告细胞(需培养基优化)，并适用于多种雄激素化合物评估。虽然3D HepaRG的酶表达谱与体内不完全一致，但功能性代谢活性(如T→AD转化)得到保持。特别值得注意的是，在生理相关浓度(10-100nM)下即能检测到代谢介导的AR反应变化，这对低剂量化合物风险评估具有重要意义。该系统可作为识别代谢调控作用的筛选工具，为NGRA提供更接近体内情况的毒性数据，推动动物实验替代方法的发展。未来可通过纳入更多细胞类型和自动化操作，进一步提升其应用价值。