基于突变重组肝片吸虫组织蛋白酶L蛋白酶的血清学检测技术在马肝片吸虫病诊断中的应用研究

本研究针对马肝片吸虫病（Fasciola hepatica）诊断灵敏度不足的问题，通过生物工程改造寄生虫组织蛋白酶L（CL）同源变异体，开发了基于突变抗原rFhCLmut的ELISA检测技术。结果显示，优化后的检测灵敏度（Se）达65%、特异性（Sp）97.4%，显著优于传统方法，并首次报道瑞士马群血清阳性率（3.5-5.7%）。该研究为马匹肝脏疾病溯源提供了可靠工具，对改善动物福利和畜牧业经济具有重要意义。

　　

研究背景

肝片吸虫（Fasciola hepatica）是全球范围内严重危害反刍动物的寄生虫，但马匹感染常被忽视。尽管马匹表现出较强的天然抵抗力，临床病例仍可能出现肝功能异常、体重下降等症状。传统粪检法因马匹感染后排卵量低且周期长，漏诊率极高。此前基于天然排泄分泌（E/S）抗原或重组组织蛋白酶L1（FhCL1）的血清学检测，存在灵敏度不足（最低仅42%）或批次差异大的缺陷。瑞士作为肝片吸虫流行区，马匹感染状况长期缺乏数据，亟需开发高精度诊断工具。

技术方法

研究团队从5种FhCL蛋白酶基因（GenBank ID: THD23701等）出发，通过BepiPred-2.0预测线性表位，对预测表位侧翼区域进行丙氨酸/酸性氨基酸替换改造，构建10种重组蛋白（5种野生型+5种突变型）。采用毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统生产抗原，通过IMAC层析纯化。使用爱尔兰屠宰场175份马血清（20阳性/155阴性）验证性能，建立相对抗体单位（rAU）计算公式，并追踪7例临床病例的抗体动态。瑞士368份存档血清用于流行病学分析。

研究结果

1. 抗原优化与筛选

表位突变使3/5候选抗原的阳性/阴性信号比（DF）显著提升，其中THD22568突变体（rFhCLmut）DF达12.6（野生型9.1）。Western blot验证其正确折叠，SDS-PAGE显示纯度>90%。

2. 诊断性能验证

以40份无接触史马血清确定cut-off值（38 rAU），在爱尔兰队列中灵敏度65%（95%CI:41-83.7）、特异性97.4%（95%CI:93.1-99.2）。ROC曲线下面积（AUC=0.88）优于既往FhCL1-ELISA（AUC=0.85）。

3. 临床病例追踪

7例疑似感染马经三氯苯达唑治疗后，谷氨酸脱氢酶（GLDH）从峰值185.3 U/L（参考值<13）降至10.9 U/L，抗体水平6-9个月后全部转阴。首次提出60 rAU为"明确阳性"阈值，38-60 rAU为"可疑区间"。

4. 瑞士流行率调查

368份样本中3.53%（95%CI:1.9-6.1）为明确阳性，加上可疑病例后总阳性率5.7%（95%CI:3.7-8.7），显著低于英国（8.7%）和西班牙（60%）。

结论与意义

通过表位定向改造技术，本研究成功将马肝片吸虫病血清检测灵敏度提升23个百分点。提出的双阈值体系（38/60 rAU）可区分急性感染与既往暴露，为临床决策提供依据。瑞士相对较低的流行率提示马匹可能通过管理措施（如与反刍动物混牧）获得保护。该成果发表于《Veterinary Parasitology》，不仅填补了阿尔卑斯地区马匹寄生虫病数据空白，更为开发跨物种诊断试剂提供了新思路——通过理性设计增强抗原-抗体亲和力，可突破传统重组蛋白诊断性能瓶颈。未来需扩大急性感染队列验证rAU与肝脏生化指标（如GGT、AST）的相关性。