美国猪场当代猪札幌病毒的分子特征与分离研究及其在疫苗开发中的应用前景

为解决猪札幌病毒(PoSaV)在猪群中引发腹泻且难以分离培养的问题，研究人员针对美国猪场开展GIII型PoSaV的分子特征与细胞分离研究，首次成功在猪睾丸(ST)细胞中分离出流行毒株，为疫苗研发提供新平台。该研究通过RT-qPCR检测发现60%样本阳性率，并在LLC-PK1和ST细胞中实现病毒扩增，测序显示新毒株与经典Cowden株存在显著差异。

　　

猪札幌病毒(PoSaV)作为猪群腹泻的重要病原体，尤其对断奶仔猪危害显著，但其研究长期受限于病毒分离困难。尽管GIII型PoSaV全球流行，自Cowden株和LL14株分离后，近三十年再无新毒株成功培养的报道。传统LLC-PK1细胞培养需添加胆汁酸且效率低下，而更符合肠道生理的IPEC-J2细胞却难以支持病毒复制。这种技术瓶颈严重阻碍了诊断试剂改进和疫苗研发进程。

为突破这一困境，俄亥俄州立大学食品动物健康中心的Bikash Aryal、Qiuhong Wang团队联合日本国立感染症研究所的Tomoichiro Oka等学者，系统采集美国内布拉斯加州5个猪场42份腹泻仔猪样本，采用多细胞系并行培养策略。研究通过建立高灵敏度RT-qPCR方法，发现农场水平阳性率达80%，其中BA21毒株在ST细胞中成功传代至P5代，病毒RNA滴度提升1000倍，填补了该细胞系培养PoSaV的技术空白。论文发表于《Veterinary Microbiology》，为猪肠道病毒防控提供了关键工具。

关键技术包括：1) 跨农场样本队列（12-28日龄腹泻仔猪）；2) 三重细胞培养体系（ST/LLC-PK1/IPEC-J2）；3) 靶向RdRp-VP1区的定量RT-qPCR；4) 免疫荧光验证病毒复制；5) 基于AlphaFold的VP1蛋白结构预测。

【分子流行病学特征】

通过全基因组测序发现，所有分离株均属GIII型但形成独立进化分支，VP1区核苷酸相似性达97.3%，但与经典Cowden株差异达13.7%。系统发育分析揭示当前流行株可能通过点突变和基因内重组进化，其中BA21毒株在ST细胞传代后出现P24S、I190V等非结构蛋白突变。

【跨细胞系培养突破】

比较三种细胞系培养效率显示：LLC-PK1细胞分离成功率最高（16%），ST细胞首次实现8%分离率，而IPEC-J2细胞全部失败。值得注意的是，BA21毒株在LLC-PK1细胞中48小时即达峰值滴度7.4 log₁₀ TCID₅₀/mL，显著高于ST细胞的5.69 log₁₀ TCID₅₀/mL（72小时）。

【结构生物学启示】

VP1蛋白的D485N突变在ST和LLC-PK1适应株中保守出现，但mCSM分析显示ST适应株的M359T突变导致蛋白稳定性下降（ΔΔG=-2.069 kcal/mol）。与Cowden株不同，新毒株的细胞适应突变未引起显著结构变化，暗示存在新的宿主适应机制。

该研究首次证明ST细胞可作为PoSaV培养的新平台，其易于规模化培养的特性为疫苗生产铺平道路。发现当前流行毒株与疫苗候选株Cowden的遗传差异，提示现有疫苗可能需更新毒株。尽管PoSaV尚未确认人畜共患风险，但GV型中人与猪毒株的共存现象，以及GI型人源序列在猪群的检出，凸显持续监测的必要性。研究者特别指出，ST细胞系已广泛应用于伪狂犬病等疫苗生产体系，这将加速PoSaV疫苗的工艺开发和审批流程。未来需深入解析VP1突变与细胞嗜性的关系，并评估分离毒株的免疫保护效力。