基于三维荧光技术的LCD-TDP43液-液相分离结构动态变化图谱研究

本文推荐：该研究创新性运用激发-发射矩阵（EEM）荧光技术，首次揭示LCD-TDP43在液-液相分离（LLPS）过程中形成的α-片层中间体结构，阐明芳香族残基π-π相互作用驱动淀粉样纤维化的分子机制，为神经退行性疾病（如ALS/FTD）的靶向治疗提供新视角。

　　

Highlight

化学试剂与材料

意大利国际遗传工程与生物技术中心的Emanuele Buratti教授惠赠LCD-TDP43质粒（编码267-414位残基，含N端六组氨酸标签）。实验使用LB培养基、卡那霉素硫酸盐、咪唑等标准试剂，所有试剂均采用分子生物学级纯度。

蛋白表达与纯化

参照既往方案诱导表达LCD-TDP43，通过镍柱亲和层析和分子筛色谱获得高纯度蛋白。超声破碎菌体后，包涵体经尿素变性复性处理，最终蛋白溶液经超滤浓缩至工作浓度，SDS-PAGE验证纯度>95%。

结果与讨论

三维荧光技术（EEM）通过捕获色氨酸等芳香残基的荧光指纹，首次绘制LCD-TDP43在LLPS路径中的动态构象图谱。研究发现：

1. 1.

   液滴态（LDs）中存在新型α-片层中间体，具有向β-淀粉样纤维转化的固有倾向

2. 2.

   疏水簇随相分离进程持续增强，伴随极性微环境变化

3. 3.

   原子力显微镜（AFM）证实从单体到纤维的多种蛋白形态共存

   该技术为理解π-π相互作用驱动的"贴纸-间隔区"（sticker-spacer）相分离模型提供直接证据。

结论

本研究建立的3D荧光监测体系，为神经退行性疾病相关蛋白（如TDP-43）的LLPS-纤维化路径研究提供创新工具。首次发现的α-片层非纤维中间体，可能成为干预ALS/FTD病理聚集的新靶点。