智能手机辅助的RCA-磁珠-脲酶级联放大比色法检测FEN1及其抑制剂

本文创新性地将滚环扩增(RCA)、磁珠(MB)富集与脲酶介导的pH显色系统相结合，开发了一种可视化检测瓣状内切酶1(FEN1)活性的智能手机比色平台。该策略通过FEN1特异性切割-连接反应触发RCA扩增，利用脲酶催化尿素水解产生氨气引起酚红染料颜色变化（黄→粉红），实现了2×10-6-0.02 U/μL范围内的灵敏检测（LOD=1.5×10-6 U/μL）。相比传统HRP系统，该方案可规避Fe3O4类过氧化物酶活性干扰，成功应用于肺癌细胞核/质蛋白提取物中FEN1活性差异分析，为肿瘤诊断和抑制剂筛选提供了新工具。

　　

Highlight

本研究巧妙融合核酸扩增技术与酶催化显色系统，将FEN1活性信号转化为肉眼可见的颜色变化，犹如给分子诊断装上了"色彩放大器"——当脲酶遇到尿素，溶液就像被施了魔法般从黄色渐变为粉红，而这一切只需用手机摄像头即可轻松捕捉。

Oligonucleotides and reagents

热稳定性FEN1（货号M0645S）、T4 DNA连接酶（M0202L）、脱氧核苷酸混合液（dNTPs，N0447L）和Phi29 DNA聚合酶（M0269L）购自New England Biolabs。所有化学试剂来自Sigma-Aldrich，1.5 μm链霉亲和素磁珠（SA-MB）购自Bangs Laboratories公司，纳米级分子筛离心柱（NANOSEP OMEGA）购自Pall公司。所有寡核苷酸序列（见表S1）由生工生物合成。

Design principle of the proposed FEN1 activity assay

这个检测机制就像一场精密的分子多米诺骨牌：首先FEN1精准剪切"发卡"探针（FDP）的5'瓣状结构，T4连接酶随即"焊接"切口形成闭环模板；接着Phi29聚合酶开启RCA扩增，像复印机般产出串联重复序列；随后脲酶标记DNA（Ur-DNA）与扩增产物特异性结合，被磁珠"钓取"后，脲酶将尿素水解为氨气，引发pH指示剂变色——整个过程犹如分子水平的"信号接力赛"。

Conclusions

我们成功构建了FEN1活性检测的"三步走"战略：靶标识别（切割-连接）、信号放大（RCA-磁珠富集-脲酶催化）和视觉转导（pH显色）。这个比色平台不仅比荧光检测更亲民，还巧妙避开了磁珠中Fe₃O₄的类过氧化物酶干扰，堪称"抗干扰小能手"。通过简单更换探针序列，这套系统还能变身其他生物标志物的检测利器。