BAK和BAX高效特异性结合蛋白的计算设计及其在细胞凋亡调控中的双相作用机制

研究人员针对凋亡关键蛋白BAK和BAX缺乏高特异性结合剂的难题，通过计算蛋白质设计结合酵母表面展示技术，开发出亲和力达皮摩尔级、特异性超100倍的αBAK2/αBAX2结合蛋白。研究发现这些结合剂在低浓度时激活BAK/BAX介导的膜穿孔，高浓度则抑制凋亡，揭示了浓度依赖的双相调控机制。该成果为精确调控凋亡通路提供了新工具，对癌症治疗及细胞工程具有重要应用价值。

　　

细胞凋亡是维持生命稳态的核心过程，其中BCL-2家族蛋白BAK和BAX作为线粒体外膜(MOM)穿孔的执行者，其异常调控与癌症、神经退行性疾病等密切相关。然而长期以来，科学界缺乏能特异性靶向BAK/BAX的高效分子工具——天然BH3-only蛋白(BOPs)结合力弱(微摩尔级)，且会同时激活多种凋亡通路；现有小分子抑制剂则存在交叉反应性强、不可逆修饰等问题。这种技术瓶颈严重阻碍了人们对BAK/BAX特异性功能的解析，也限制了精准凋亡调控疗法的开发。

为突破这一困境，研究团队在《SCIENCE ADVANCES》发表的研究中，创新性地将计算蛋白质设计与定向进化技术相结合。通过Rosetta软件将三螺旋支架蛋白BINDI对接至BAK/BAX的BH3结合沟槽，设计出42种候选蛋白；利用酵母表面展示(YSD)筛选后，经两轮饱和突变和组合文库优化，最终获得αBAK2(BAK结合K_d=400 pM)和αBAX2(BAX结合K_d=3 nM)。关键技术包括：基于结构的计算设计、酵母表面展示高通量筛选、生物层干涉术(BLI)定量结合分析、X射线晶体结构解析，以及脂质体渗透和细胞线粒体 cytochrome c释放实验等功能验证。

计算结果与结构验证

通过将BINDI支架与BAK/BAX的BH3沟槽对接，设计出的αBAK2晶体结构显示其精确结合在BAK的α3-α5螺旋区域，并诱导BAK发生"解扣"(unlatched)构象变化，使α6-α8螺旋脱离核心。值得注意的是，αBAK2的结合模式与设计模型高度吻合(Cα RMSD仅2.6 ?)，其BH3模拟残基h1-h4完美占据BAK的疏水口袋。

浓度依赖的双相调控

在脂质体实验中，αBAK2展现出独特的"双刃剑"特性：低浓度(≤38 nM)时通过诱导BAK构象变化激活膜穿孔，效率堪比天然激活剂cBID；但当浓度超过BAK摩尔量(IC₅₀=51.9 nM)时则完全抑制穿孔。类似现象在αBAX2中也存在，但抑制BAX需更高浓度(1000倍过量)，这与BAX的C端α9螺旋竞争性结合有关——截去α9的BAXdC21仅需2-4倍过量αBAX2即可被抑制。

细胞水平验证

在表达人BAK的基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)中，αBAK2低浓度(4 nM)即诱导cytochrome c释放，而≥333 nM时完全阻断cBID的激活作用。对于BAX，从鼠肝线粒体实验发现120 μM αBAX2能有效抑制BAX介导的cytochrome c释放，证实其生理相关性。

这项研究首次实现了对BAK/BAX的高效特异性靶向，其创新价值体现在三方面：

1. 1.

   技术突破：将计算设计的结合亲和力提升2个数量级(较天然BOPs)，同时实现>100倍特异性，避免与抗凋亡蛋白(如BCL-2)交叉反应；

2. 2.

   机制发现：揭示BAK/BAX结合剂存在浓度依赖的"激活-抑制"转换，为凋亡调控提供新范式——抑制需要作用位点的结合剂饱和，而亚饱和浓度反而促进凋亡；

3. 3.

   应用前景：αBAX2可作为选择性BAX激活剂用于基础研究，而αBAK2的抑制特性在细胞治疗(如防止CAR-T细胞耗竭)和缺血再灌注损伤保护中具有转化潜力。

该研究不仅填补了凋亡调控工具的关键空白，更通过结构-功能解析为靶向BAK/AX的药物设计提供了理论框架。正如作者强调的，针对BAX的小分子抑制剂开发需转向非BH3沟槽位点，而BAK抑制则可通过优化结合动力学实现——这些见解将深刻影响未来细胞死亡调控策略的发展方向。