视网膜基因治疗新突破：基于AAV-纤维蛋白水凝胶的视网膜上植入技术实现高效安全转导

研究人员针对视网膜基因治疗中传统视网膜下注射(Subretinal injection)导致的脉络膜视网膜萎缩(CRA)和转导不均等问题，创新性地开发了含有腺相关病毒(AAV2-GFP)的高浓度纤维蛋白(fibrin)水凝胶视网膜上植入技术。通过猪模型实验证实，该技术可实现视网膜色素上皮(RPE)广泛转导且无炎症反应，为遗传性视网膜病变治疗提供了更安全有效的递送方案。

　　

视网膜基因治疗领域面临重大技术瓶颈。2017年FDA批准的首个体内基因疗法Luxturna（voretigene neparvovec-rzyl）虽开创了遗传性视网膜疾病治疗新纪元，但临床数据显示10.3-28.2%患者在接受视网膜下注射后出现脉络膜视网膜萎缩(CRA)。这种因机械性视网膜脱离导致的并发症，在视网膜-视网膜色素上皮(RPE)黏附异常的遗传性视网膜病变患者中风险更高。更棘手的是，传统方法只能转导注射区域（约20%视网膜），对于需要全视网膜治疗的疾病如视网膜色素变性极为不利。

为突破这些限制，Mayo Clinic研究团队在《SCIENCE ADVANCES》发表创新性研究，开发了含AAV2-GFP的高浓度纤维蛋白(fibrin)水凝胶视网膜上植入技术。该技术通过注射成型法制备厚度181±1μm的标准化水凝胶，其弹性模量(0.042-0.053 MPa)与视网膜相当，确保手术安全性。研究对比了视网膜上植入(n=11)、视网膜下注射(n=5)和玻璃体内注射(n=3)三种递送方式的效果。

关键技术包括：1）含胰蛋白酶蓝的注射成型技术制备标准化水凝胶；2）光学相干断层扫描(OCT)和电子显微镜表征材料特性；3）猪模型手术系统评估；4）免疫组化(IHC)和免疫荧光(IF)分析转导效率；5）实时定量PCR(qPCR)检测病毒分布。

CRA和转导问题

视网膜下注射组40%出现CRA，OCT血管成像(OCT-A)显示脉络膜毛细血管血流减少，组织学证实RPE空泡化和色素异常。转导呈现"马赛克"现象，相邻细胞表达差异显著。

水凝胶制备技术

创新性地利用胰蛋白酶蓝延缓聚合，实现30 mg/ml高浓度纤维蛋白的注射成型。扫描电镜(SEM)显示AAV颗粒(25-31 nm)均匀分布在纤维网络中，体外实验证实55%病毒在48小时内缓释。

手术创新

在猪模型中使用定制注射器将1.5×5 mm水凝胶置于视网膜表面，全氟化碳(PFO)和自体血清确保定位。术后5天降解完全，OCT证实无机械损伤。

转导效果

视网膜上植入组实现RPE全视网膜转导，GFP免疫染色显示均匀表达，显著优于局限在注射区的视网膜下组和弱表达的玻璃体注射组。值得注意的是，玻璃体注射组出现严重炎症反应，而水凝胶组无临床炎症迹象。

安全性验证

通过qPCR检测证实AAV未扩散至前段或肝脏。胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色显示水凝胶组未引起 Müller细胞胶质化，而其他两组均出现不同程度的神经胶质活化。

这项研究的意义在于：首次证明视网膜上递送可突破内界膜(ILM)屏障实现RPE广泛转导；纤维蛋白水凝胶作为AAV载体可降低病毒用量并减少全身暴露风险；手术方案规避了视网膜脱离风险。研究者已将该技术成功应用于人类难治性黄斑裂孔修复案例，26个月随访显示良好安全性。该平台技术不仅适用于眼科，未来还可拓展至关节腔、心包等组织的靶向基因治疗。