单核细胞增生李斯特菌腺苷营养缺陷型突变体的胞内外生长缺陷与保留强免疫原性的研究

这篇研究深入探讨了单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）腺苷酸合成关键基因purA缺失对细菌胞内生长、血液环境适应及免疫原性的影响。通过构建purA缺失突变体（ΔpurA），研究发现其虽能逃逸吞噬体但胞内增殖严重受限，且在血清和血液中无法生长，展现出显著的安全性优势。值得注意的是，ΔpurA突变体通过独特的脾脏免疫细胞定位（如CD8+ cDC1）诱导了比传统ΔactA突变体更强的CD8+ T细胞应答，为开发更安全的李斯特菌载体疫苗（如肿瘤免疫治疗）提供了新策略。

　　

腺苷营养缺陷型李斯特菌的致病与免疫机制

ABSTRACT

单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）作为兼性胞内病原体，因其诱导强细胞免疫的能力成为肿瘤治疗载体候选。本研究通过删除腺苷酸合成酶基因purA，构建腺苷营养缺陷型突变体（ΔpurA），系统评估了腺苷单磷酸（AMP）合成在细菌感染与免疫中的双重作用。

INTRODUCTION

李斯特菌通过逃逸吞噬体、胞质增殖及抗原分泌等机制激活宿主免疫，但其临床疫苗应用仍面临安全性挑战。嘌呤代谢（尤其是IMP→AMP通路）被预测为细菌胞内存活的关键，但具体机制尚不明确。

RESULTS

ΔpurA突变体的腺苷依赖性

ΔpurA在化学限定培养基（LSM）中仅在外源腺嘌呤/腺苷（100-500 μM）存在时生长，而ΔpurEK（IMP合成缺陷）可通过次黄嘌呤补救途径增殖，证实PurA特异性催化AMP合成的不可替代性。

胞内生长与吞噬体逃逸

在骨髓来源巨噬细胞（BMMs）中，ΔpurA虽能实现70%的吞噬体逃逸（p62⁺细菌占比），但胞质增殖完全依赖外源腺苷补充。相反，其在L2成纤维细胞中形成正常空斑，提示不同宿主细胞的嘌呤微环境差异。

血液适应性缺陷

ΔpurA在脱纤维羊血中48小时无增殖，在人血清中仅腺苷（非次黄嘌呤）可挽救其生长缺陷。与传统疫苗株ΔactA（血清中生长正常）相比，ΔpurA的胞外生长缺陷显著降低了临床传播风险。

体内动力学与免疫细胞互作

小鼠静脉感染模型显示，ΔpurA在脾脏中呈现独特生长曲线：12-24小时延迟增殖，48小时与ΔactA清除率相当。流谱分析揭示ΔpurA优先定植于脾脏CD8⁺ cDC1（占比显著高于ΔactA），这类树突细胞以抗原交叉提呈效率著称。

强效免疫保护

低剂量（10³ CFU）ΔpurA免疫即可诱导与高剂量ΔactA相当的CD8⁺ T细胞应答（IFN-γ⁺TNF-α⁺双阳性细胞增加），并对野生型攻击提供完全保护，其免疫优势可能与ActA依赖的CD8⁺ DCs感染及潜在c-di-AMP信号调节有关。

DISCUSSION

研究揭示了AMP合成对李斯特菌胞内寄生和血液适应的必要性，同时发现代谢缺陷可重塑细菌-免疫细胞互作模式。ΔpurA兼具安全性（无胞外增殖）与强免疫原性（靶向cDC1），为优化活载体疫苗提供了新思路。未来需在肿瘤模型（高腺苷微环境）中验证其治疗潜力。

MATERIALS AND METHODS

实验采用10403S菌株背景，通过等位基因交换构建突变体，LSM培养基评估营养需求，BMMs和流式细胞术分析感染动力学，OVA抗原系统量化T细胞应答。统计采用GraphPad Prism 9.2完成。