军事工作犬新型巴尔通体（Candidatus Bartonella merieuxii）多重血清学检测方法的建立及伊拉克部署感染率研究

这篇研究报道了针对军事工作犬（MWD）的新型巴尔通体（Candidatus B. merieuxii, CBm）多重电化学发光免疫检测法（ECLIA）的开发与应用。通过筛选20种线性B细胞表位肽段，结合传统间接免疫荧光（IFA）和PCR验证，证实27%的伊拉克部署犬存在CBm血清转换，为这一未培养病原体的流行病学监测提供了高灵敏度、低样本量的诊断工具，同时揭示了MWD作为人兽共患病（zoonosis）哨兵的重要性。

　　

ABSTRACT

巴尔通体（Bartonella）对军事工作犬（MWD）构成重大健康威胁，这类人兽共患病原体也可导致人类疾病。美国陆军人兽共患病监测项目显示，伊拉克流浪犬的巴尔通体血清阳性率达47.4%，其中37%通过gltA和rpoB基因测序鉴定为新型物种——暂定名巴尔通体梅里厄氏种（Candidatus B. merieuxii, CBm）。本研究旨在开发针对CBm的犬血清学检测方法，并评估MWD在伊拉克部署期间的感染率。通过生物信息学预测20个B细胞线性表位肽段，建立多重电化学发光免疫检测平台。对52只MWD的部署前后配对样本检测显示，27%（14/52）的犬呈现显著抗体差异，提示部署期间血清转换。该检测法具有高通量、低样本需求等优势，为巴尔通体监测提供了新工具。

IMPORTANCE

MWD在伊拉克可能接触当地流行的CBm，而既往至少3例MWD因巴尔通体感染死亡。本研究开发的检测方法可识别北美尚未分布的CBm，对防控新病原体入侵具有重要意义。

INTRODUCTION

巴尔通体是革兰阴性、血源性、难培养的胞内菌，通过节肢动物媒介传播。犬感染可表现为无症状至致命性心内膜炎，其中B. vinsonii subsp. berkhoffii曾导致3例MWD死亡。伊拉克所在的东地中海地区已报道18种巴尔通体，CBm在伊拉克流浪犬、伊朗犬及中东野生动物中均有检出，但传播媒介尚未明确。现有IFA和PCR检测存在灵敏度低、种间交叉反应等问题，且CBm无法体外培养，亟需新型诊断方法。

MATERIALS AND METHODS

研究纳入2005-2022年部署伊拉克的MWD，收集部署前后血清和全血样本。传统检测包括：

1. 1.

   IFA：以B. vinsonii subsp. berkhoffii、B. bovis等为抗原，阈值滴度128；

2. 2.

   qPCR：靶向ftsZ基因，阳性样本进行rpoB测序；

3. 3.

   多重ECLIA：基于B. bovis（与CBm亲缘最近）和B. bacilliformis的GroEL、鞭毛蛋白等保守蛋白预测表位肽段，筛选出20个候选肽（表1），通过MSD平台检测IgG反应性。

RESULTS

Demographic and clinical characteristics

100只MWD以比利时牧羊犬（48%）、德国牧羊犬（45%）为主，部署期间平均体重下降0.53 kg，未发现与巴尔通体感染显著相关的临床表现。

Conventional diagnostic results

112对样本中，8只（7.1%）IFA阳性，其中4只对CBm替代抗原B. bovis血清转换；1例全血PCR检出CBm（rpoB序列同源性99.9%）。

Multiplex assay performance

ECLIA检测显示：

1. 1.

   B. bovis肽段P11/P13和CBm肽段P15-P17能区分阴性对照与阳性样本（P<0.001）；

2. 2.

   14只MWD（27%）显示部署后血清转换，远高于IFA检出率；

3. 3.

   PCA分析证实P15-P17对CBm检测具有特异性贡献（图3-4）；

4. 4.

   交叉反应分析显示57%样本同时识别B. bovis和CBm肽段（图5）。

DISCUSSION

本研究首次建立针对未培养病原体CBm的多重血清学检测：

1. 1.

   优势：较IFA灵敏度提升7.5倍，可检测既往暴露史，且需血清量仅1 μL；

2. 2.

   局限性：GroEL蛋白保守性导致部分交叉反应，需进一步优化种特异性肽段；

3. 3.

   流行病学意义：证实MWD在伊拉克暴露于CBm，德国牧羊犬血清阳性率更高（75%），提示品种易感性差异；

4. 4.

   临床价值：为无症状感染监测提供工具，弥补现有IFA/PCR的不足。

Conclusion

该ECLIA平台可高效检测MWD的CBm感染，未来通过纳入更多特异性肽段，有望成为巴尔通体血清分型的标准方法。研究同时警示需加强MWD跨境部署时的病原体筛查，防止CBm传入北美。

ACKNOWLEDGMENTS

感谢美国武装部队健康监测局（GEIS）资助（P0042_22_HS），以及NCSU胞内病原体实验室的技术支持。声明：Breitschwerdt博士担任Galaxy Diagnostics科学顾问，该公司提供巴尔通体检测服务。