辣椒细胞质雄性不育恢复基因Rfa的精细定位与多组学联合解析及其在花粉外壁发育中的调控机制

为解决辣椒(Capsicum annuum L.)细胞质雄性不育(CMS)恢复基因分子机制不明的问题，研究人员通过第三代基因组CA59结合BSA-seq和图位克隆技术，精细定位新恢复基因位点Rfa至6号染色体311 kb区间，发现三个PPR基因簇候选基因。多组学联合分析揭示Rfa通过下调孢粉素合成关键基因，干扰苯丙烷类、角质层代谢通路导致花粉败育。该研究为辣椒三系杂交制种提供了理论支撑和分子标记资源。

　　

在蔬菜育种领域，辣椒作为全球种植面积最大的调味作物，其杂交种子的生产效率直接影响产业效益。然而传统人工去雄方式成本高昂且纯度难以保障，细胞质雄性不育(CMS)系统因其能产生100%不育株的特性，成为解决这一难题的"金钥匙"。但CMS系统的应用效果高度依赖于恢复育性的Rf基因，这些基因如同"基因修复师"，能够逆转线粒体基因突变导致的不育表型。尽管在水稻、油菜等作物中已克隆多个Rf基因，但辣椒由于基因组复杂性，相关研究长期受限于二代基因组的不完整性，导致已报道的CaPPR6等候选基因甚至无法准确定位于参考染色体上。

为解决这一瓶颈问题，来自湖北省农业科学院经济作物研究所的Kai Xu、Xiaodi Wang等研究者选取CMS系1310A与恢复系CA1403构建遗传群体，结合第三代基因组CA59和前沿组学技术展开攻关。研究首先通过3120株BC₁F₂群体进行精细定位，开发共分离标记CAPS-170；利用石蜡切片锁定小孢子败育关键时期；最后整合转录组和代谢组数据解析分子调控网络。

主要技术方法

研究采用第三代基因组CA59为参考，通过BSA-seq初步定位候选区间；开发24个CAPS标记完成从7.9 Mb到311 kb的精细定位；选取2-3 mm花蕾进行转录组(MGI平台测序)和代谢组(LC-MS)分析；使用RT-qPCR验证候选基因表达模式，内参为CaUBI-3。

3.1 表型与石蜡切片观察

通过醋酸洋红染色证实1310A花粉完全败育，而F₁代呈现显性恢复特征。石蜡切片显示不育株F₂-138S在四分体时期出现绒毡层异常 vacuolization（液泡化），导致不规则四分体结构形成，这与已报道的HZ1A材料败育时期存在差异。

3.3-3.4 Rfa基因定位

BSA-seq在6号染色体186.52-220.11 Mb区间检测到显著峰，通过开发CAPS-241和CAPS-227标记将Rfa锁定在241.633-241.944 Mb物理区间。该区间在二代基因组Zunla-1中仅部分可比对，凸显三代基因组优势。

3.5 候选基因分析

预测到Chr06g034210/034220/034250三个串联PPR基因，其编码区在亲本间存在显著差异：034250启动子区存在13 bp插入和404 bp缺失。表达谱显示这些基因在花蕾中高表达，且育性株6 mm时期的表达量显著高于不育株。

3.6 多组学联合分析

转录组发现921个下调基因显著富集于孢粉素合成（如TKPR1、PKSA）和花粉外壁形成通路。代谢组揭示苯丙烷类、角质和蜡质合成受阻，关键中间产物如阿魏酸、芥子酸显著减少。这种"双刃剑"效应导致花粉外壁构建既缺原料（孢粉素前体）又缺能量（糖代谢紊乱）。

结论与意义

该研究首次在辣椒中报道Rfa新恢复位点，其三点突破尤为关键：1）利用三代基因组解决候选基因"定位模糊"难题；2）发现PPR基因簇可能通过"协同调控"模式发挥作用；3）阐明Rfa通过TKPR1-PKSA-CYP703A2级联反应影响孢粉素合成的分子路径。这些发现不仅为分子标记辅助育种提供靶点CAPS-170，更揭示了温度敏感型不育系创制的新思路。论文发表于园艺学权威期刊《Scientia Horticulturae》，为辣椒杂交种子"去雄难、成本高"的产业困境提供了分子育种方案。

值得关注的是，与已报道的CaRf032等基因相比，Rfa候选基因在Zunla-1基因组中缺乏同源序列，暗示辣椒CMS/Rf系统可能存在更复杂的物种特异性演化机制。后续通过基因编辑验证三个PPR基因的具体功能，将有助于解析该基因簇的"分工协作"原理，为创制广谱恢复系提供理论依据。